孫玉滿 吳 蒙 劉宏俠 梁 振

喉癌切緣組織中p53 p21及PCNA表達(dá)及其與腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系

孫玉滿①吳 蒙①劉宏俠①梁 振②

目的：研究早期喉癌手術(shù)切緣陰性組織中p53、p21及PCNA表達(dá)的相關(guān)性及其與腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系。方法：選取唐山市協(xié)和醫(yī)院2004年1月至2010年12月間92例早期喉癌患者為研究對象，采用免疫組織化學(xué)法聯(lián)合檢測腫瘤及其切緣組織中p53、p21及PCNA的表達(dá)情況。電話隨訪2年以上，對患者生存及腫瘤復(fù)發(fā)情況進(jìn)行觀察。結(jié)果：p53、p21及PCNA蛋白在喉癌組織中的表達(dá)與腫瘤的分級及分期無關(guān)。92例喉癌患者術(shù)后2年內(nèi)有16例出現(xiàn)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為17.39%。喉癌陰性切緣復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)標(biāo)本中p53、p21及PCNA蛋白表達(dá)陽性的切緣復(fù)發(fā)率分別為50.00%、34.21%和33.33%，明顯高于p53、p21及PCNA蛋白表達(dá)陰性的切緣（8.33%、5.56%和9.68%）。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，喉癌復(fù)發(fā)標(biāo)本3種蛋白切緣陽性率明顯高于未復(fù)發(fā)標(biāo)本，均有顯著性差異（P＜0.01）。此外，喉癌陰性切緣組織中p53與p21蛋白的表達(dá)有明顯的相關(guān)性，PCNA的表達(dá)與p21的表達(dá)亦有明顯的相關(guān)性。結(jié)論：早期喉癌手術(shù)病理陰性切緣組織中的p53、p21及PCNA是患者預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志，聯(lián)合檢測喉癌切緣組織中p53、p21及PCNA的表達(dá)有望作為預(yù)測喉癌復(fù)發(fā)的指標(biāo)。

喉鱗狀細(xì)胞癌 局部復(fù)發(fā) p53 p21 PCNA

喉癌是頭頸部較常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病與多種病因?qū)W機(jī)制有關(guān)。目前早期喉癌的治療仍以手術(shù)治療為主，但仍有10%～30%患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)［1-2］。隨著對腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，很多研究顯示腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞周期調(diào)控失常密切相關(guān)［3-4］。細(xì)胞周期調(diào)控是由多種基因參與、多條信號傳導(dǎo)通路實現(xiàn)，其中較為重要的一條就是p53-p21信號通路，但對于該通路在喉癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未闡明。為此本研究選取該通路中涉及到的重要蛋白基因p53、p21及PCNA，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測這些蛋白在早期喉癌及其在陰性切緣組織中的表達(dá)情況，旨在探討其在喉癌發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)過程中的作用及相互關(guān)系，為喉癌患者的術(shù)后隨訪和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 選取唐山市協(xié)和醫(yī)院2004年1月至2010年12月92例有完整隨訪資料的早期喉鱗狀細(xì)胞癌患者，采用二氧化碳激光手術(shù)切除標(biāo)本，保留癌旁組織5 mm作為手術(shù)切緣。其中男性82例，女性10例，年齡45～75歲，平均年齡（58.4±15.6）歲。腫瘤病理分級按高、中、低分化劃分，其中高分化34例，中分化42例，低分化16例。按TNM分期均為T1期，其中T1a期40例，T1b 52例。手術(shù)切緣組織病理檢查均為陰性。

1.1.2 病例選擇 納入研究的患者經(jīng)過受試對象或其親屬知情同意，均有完整的隨訪資料，術(shù)前均未接受過放療和化療，且未服用過非甾體類抗炎藥物；同時排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中、晚期腫瘤患者。

1.2 方法

1.2.1 檢測設(shè)備及試劑 p53蛋白單克隆抗體Do-1、鼠抗人p21蛋白單克隆抗體及鼠抗PCNA均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，其中鼠抗人p21蛋白單克隆抗體為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。3種抗體工作液濃度均為1：100；SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2 切緣標(biāo)本留取方法 腫瘤整塊切除后，于腫瘤周圍5 mm留切取4塊組織作為切緣，有黏膜處盡量切取部分黏膜組織。標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)處理，置于10%甲醛溶液中固定，石蠟切片脫蠟水化。

1.2.3 檢測方法 采用鏈霉素親生物素-過氧化物酶法（SP）免疫組織化學(xué)檢測。用PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.2.4 陽性判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組織化學(xué)染色陽性信號呈棕褐色或棕黃色，其中p53定位于細(xì)胞核，p21蛋白多數(shù)定位于細(xì)胞核中，核周、胞漿內(nèi)也可同時有少數(shù)陽性；PCNA蛋白陽性標(biāo)準(zhǔn)分別是原發(fā)病灶組織中癌細(xì)胞有明顯的核棕黃色染色數(shù)目≥10%，胞漿內(nèi)也可同時有少數(shù)陽性；手術(shù)切緣組織中黏膜的基底細(xì)胞中有PCNA特征染色細(xì)胞數(shù)≥5%。觀察染色切片中10個具有代表性的高倍視野，細(xì)胞核內(nèi)可見棕黃色為陽性細(xì)胞，其細(xì)胞陽性數(shù)≥10%定為陽性，陽性細(xì)胞＜10%或無著色者定為陰性。

1.2.5 隨訪 92例患者均建立隨訪檔案，術(shù)后均對腫瘤組織與切緣組織進(jìn)行病理檢查，每3～6個月通過電話或門診隨訪，對局部復(fù)發(fā)情況進(jìn)行記錄，隨訪2年以上。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料使用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p53、p21及PCNA檢測結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，喉癌患者腫瘤組織中p53、p21及PCNA蛋白的陽性表達(dá)率分別為65.22%（60/92）、52.17%（48/92）及69.57%（64/92）。切緣組織中p53、p21及PCNA蛋白的陽性表達(dá)率分別為21.74%（20/92）、41.30%（38/92）及32.61%（30/92）。p53、p21及PCNA蛋白在喉癌組織中的表達(dá)與腫瘤的分級及分期無關(guān)（圖1～6，表1）。

2.2 切緣組織中p53、p21及PCNA的表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系

92例早期喉癌患者中16例在2年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為17.39（16/92）%。p53、p21及PCNA陽性切緣患者的復(fù)發(fā)率明顯高于陰性切緣患者，有顯著性差異（χ2=18.910，P＜0.001；χ2=12.750，P＜0.001；χ2= 7.875，P＜0.01；表2，3）。

圖1 喉癌組織中p53陽性表達(dá)（SP×100）Figure 1 Positive expression of p53 in laryngeal carcinoma（SP×100）

圖2 切緣組織中p53陽性表達(dá)（SP×100）Figure 2 Positive expression of p53 in surgical margin tissues（SP×100）

圖3 喉癌組織中p21陽性表達(dá)（SP×100）Figure 3 Positive expression of p21 in laryngeal carcinoma（SP×100）

圖4 切緣組織中p21陽性表達(dá)（SP×100）Figure 4 Positive expression of p21 in surgical margin tissues（SP×100）

圖5 喉癌組織中PCNA陽性表達(dá)（SP×100）Figure 5 Positive expression of PCNA in laryngeal carcinoma（SP×100）

圖6 切緣組織中PCNA陽性表達(dá)（SP×100）Figure 6 Positive expression of PCNA in operation cut edge tissue（SP×100）

表1 p53、p21及PCNA在喉癌組織中的表達(dá)Table 1 Expression of p53，p21，and PCNA in laryngeal carcinoma

表2 切緣組織中p53和p21表達(dá)與局部復(fù)發(fā)情況Table 2 Expression of p21 and p53 in surgical margin tissues and local recurrence

表3 切緣組織中PCNA與局部復(fù)發(fā)情況Table 3 PCNA expression in surgical margin tissues and local recurrence

2.3 切緣組織中PCNA與p53及p21表達(dá)的關(guān)系

p53陽性切緣組織中p21陽性表達(dá)率為90.00%，明顯高于p53陰性切緣組織中p21的陽性表達(dá)率（27.78%），有顯著性差異（χ2=24.996，P＜0.001）；p21陽性切緣組織中PCNA陽性表達(dá)率為73.68%，明顯高于p21陰性切緣組織中PCNA的陽性表達(dá)率（3.70%），有顯著性差異（χ2=49.706，P＜0.001，表4）。p53陽性切緣組織中PCNA陽性表達(dá)率為50.00%，與p53陰性切緣組織中PCNA的陽性表達(dá)率（8.33%）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.517，P＞0.05，表5）。

表4 切緣組織中p53和p21蛋白表達(dá)的關(guān)系Table 4 Relationship between the expression of p53 and p21 in surgical margin tissues

表5 切緣組織中PCNA與p53和p21的蛋白表達(dá)的關(guān)系Table 5 Correlation among the expression of PCNA surgical margin tissues，p53 surgical margin tissues，and p21,p53 and p21 in proteins in edge tissues

3 討論

喉癌是一種浸潤性強(qiáng)、生長速度快的惡性腫瘤，術(shù)后切緣組織病理檢查陰性并不能保證術(shù)后無局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性。而復(fù)發(fā)后大多數(shù)患者將失去再次手術(shù)的機(jī)會，預(yù)后較差。目前認(rèn)為陰性切緣出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)有兩種機(jī)制：一種是可能存在殘存病灶，即切緣不凈。目前組織形態(tài)學(xué)技術(shù)尚不能檢測出殘余腫瘤細(xì)胞即所謂的微小殘存癌（minimal residual cancer，MRC）。另一種是患者可能已經(jīng)發(fā)生了分子水平改變的癌前病變，最終會演變成浸潤性癌，可采用免疫組織化學(xué)、RT-PCR、FISH等技術(shù)進(jìn)行術(shù)后檢測，以鑒定局部復(fù)發(fā)的潛在分子標(biāo)志物。但是，目前尚無喉癌特異性的腫瘤標(biāo)志物預(yù)測其復(fù)發(fā)風(fēng)險，因此本研究選擇聯(lián)合檢測p53、p21及PCNA以預(yù)警術(shù)后復(fù)發(fā)。

野生型p53是最常見的抑癌基因之一，通過多種途徑發(fā)揮抑癌作用，被譽(yù)為維持人類基因組穩(wěn)定性的“分子警察”。相反，突變型p53基因則發(fā)揮著原癌基因的作用，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［5］。p53基因的突變幾乎見于所有的人類腫瘤中。野生型p53蛋白在體內(nèi)以四聚體形式存在，半衰期僅6～20 min，免疫組織化學(xué)無法檢出。突變型p53蛋白的半衰期明顯延長，可通過免疫組織化學(xué)方法檢出［6］。在腫瘤細(xì)胞中，野生型p53基因通常已發(fā)生突變，突變的p53已失去對細(xì)胞的監(jiān)視作用，不能引起發(fā)生突變細(xì)胞的增殖停滯和凋亡，使攜帶受損及錯配DNA的細(xì)胞仍然能夠進(jìn)入S期，最終導(dǎo)致癌變的發(fā)生［7］。p21蛋白是具有廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白，其主要通過控制G2/M檢查點抑制細(xì)胞異常增殖來協(xié)助細(xì)胞完成DNA的損傷修復(fù)，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)［8-9］。在表達(dá)水平上，p21基因存在p53依賴性和非p53依賴性兩種途徑，而p21表達(dá)與腫瘤預(yù)后關(guān)系的臨床研究報道也不盡相同［10］。p21在各種腫瘤中表達(dá)的不一致，是抑癌基因還是癌基因目前尚有爭議。一方面，早期的研究顯示p21應(yīng)答各種環(huán)境刺激時，阻滯細(xì)胞周期，支持p21是抑癌基因觀點。此外，生物化學(xué)和遺傳研究表明，p21不依賴于經(jīng)典p53抑癌基因信號通路，充當(dāng)多種抑癌基因信號通路中促進(jìn)抗增殖的主要的效應(yīng)器。盡管其最主要的作用是抑制細(xì)胞增殖，并能促進(jìn)細(xì)胞分化和衰老，但在某種條件下p21能促進(jìn)細(xì)胞增殖并有致癌性。因此，p21在人類各種腫瘤中常常不表達(dá)，其表達(dá)取決于細(xì)胞環(huán)境。PCNA是分子量為36 kD的一種酸性蛋白，定位于細(xì)胞核，是DNA聚合酶δ的輔助因子，在DNA的復(fù)制、修復(fù)及正常細(xì)胞周期中起重要作用［11］。PCNA的含量隨細(xì)胞增殖周期的不同階段而發(fā)生變化，其變化與DNA合成情況一致，可反映細(xì)胞增殖的程度，是人類腫瘤及其預(yù)后的重要指標(biāo)［12-13］。

本研究中，92例早期喉癌患者術(shù)后2年內(nèi)有16例出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為17.39%。p53、p21及PCNA蛋白在早期喉癌組織中有一定程度的表達(dá)，但表達(dá)程度與腫瘤的分級和分期并無明顯關(guān)系，這與已報道的研究［14-15］結(jié)論一致。同時，p53、p21及PCNA在復(fù)發(fā)組切緣組織中的表達(dá)率明顯高于未復(fù)發(fā)組。研究發(fā)現(xiàn)，p21是p53基因下游的激活產(chǎn)物，一般認(rèn)為p53被激活后將引起p21的過量表達(dá)，p21則可通過抑制CDK2的活性來抑制細(xì)胞周期進(jìn)程［16］。本研究中切緣組織p53與p21蛋白表達(dá)關(guān)系提示，陰性切緣組織中p53蛋白表達(dá)陽性者p21蛋白表達(dá)陽性率較高，且兩者均過表達(dá)者術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于兩者均為陰性的患者。p21作為細(xì)胞周期中的重要調(diào)控因子，在分子結(jié)構(gòu)上有與p53、CDK及PCNA的結(jié)合區(qū)，但如p53失活，則不能誘導(dǎo)p21抑制CDK的活性。腫瘤組織中表達(dá)的p53多已發(fā)生突變，這常導(dǎo)致p21的異常表達(dá)，產(chǎn)生細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［17］。在研究PCNA和p21的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，PCNA和p21表達(dá)均為陽性的切緣中患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于兩者均為陰性者。在正常細(xì)胞中，p21是與細(xì)胞周期素（Cyclin）、蛋白激酶（CDK）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）形成四元復(fù)合物的形式而存在，p21的N端可與CDK2結(jié)合，C端可與PCNA結(jié)合從而抑制二者的活性，但在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制紊亂，p53失活，不能誘導(dǎo)p21抑制CDK及PCNA的活性，從而導(dǎo)致了細(xì)胞的異常增殖［9，13，18］。而PCNA的過表達(dá)則說明細(xì)胞已在分子水平上發(fā)生了多種蛋白表達(dá)的改變，且這種變化往往先于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，可能是陰性切緣患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)的原因之一。因腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多步驟、多種蛋白參并涉及到多條信號傳導(dǎo)通路，因而關(guān)于喉癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚有待進(jìn)一步探究。

總之，p53、p21及PCNA在喉癌切緣組織中同時表達(dá)的患者，術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)的概率將高于三者均為陰性的患者。本研究通過聯(lián)合檢測喉癌術(shù)后陰性切緣組織中的蛋白表達(dá)情況，探討了p53、p21及PCNA蛋白在喉癌的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)過程中的作用，初步結(jié)果表明，p21介導(dǎo)的p53依賴途徑激活的PCNA，可能參與了喉癌的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)過程。用免疫組織化學(xué)方法聯(lián)合檢測早期喉癌及其手術(shù)切緣中p53、p21和PCNA表達(dá)狀態(tài)將為篩選術(shù)后復(fù)發(fā)的高?；颊咛峁┯幸鎱⒖?，對于手術(shù)切緣組織中p53、p21和PCNA表達(dá)產(chǎn)物陽性的患者應(yīng)密切隨訪，縮短隨訪間隔時間，如發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，必要時可再次手術(shù)切除腫瘤。

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（2014-03-27收稿）

（2014-05-27修回）

（本文編輯：邢穎）

Expression of p53,p21,and PCNA and its correlation with recurrence in the negative surgical margin of early-stage laryngeal cancer

Yuman SUN1,Meng WU1,Hongxia LIU1,Zhen LIANG2

Hongxia LIU;E-mail:lhx1lmq@126.com
1Department of Pathology;2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,Tangshan Union Hospital,Tangshan 063001, China

Objective:To explore the correlation among the expression of p53,p21,and PCNA in the negative surgical margin of early laryngeal cancer and its relationship with local recurrence of the cancer.Methods:Data of 92 patients with early laryngeal cancer admitted to the Tangshan Union Hospital from 2004 January to 2010 December were selected.Immunohistochemical method was used to detect the expression of p53,p21,and PCNA in the negative surgical margin tissues of cancer.All patients were followed up for two years to observe survival status and tumor recurrence.Results:The expression of P53,p21,and PCNA had no differences in the cancer tissues in terms of grade and stage.Two years after the surgery,16 of the 92 patients with laryngeal cancer presented recurrence with a rate of 17.39%.The recurrence rates of expression of p53,p21 and PCNA protein in the positive cut edge were 50.00%,34.21%and 33.33%,significantly higher than those of negative ones(8.33%,5.56%and 9.68%).The positive rates of the three proteins were higher in the recurrence specimen than in the non-recurrence while there was a significant correlation between expression of PCNA and p21 (P＜0.01).The expression of both p21 and p53 in laryngeal carcinoma was also significantly correlated with the negative margin.Conclusion:The expression of p53,p21,and PCNA in the surgical margin of early laryngeal cancer are valuable biological markers for the prognosis of these patients.Thus,combined detection of p53,p21,and PCNA in laryngeal margin tissues can be used as a predictive indicator of the recurrence.

laryngeal squamous cell carcinoma,local recurrence,p53,p21,PCNA

10.3969/j.issn.1000-8179.20140420

①唐山市協(xié)和醫(yī)院病理科（河北省唐山市063001）；②耳鼻咽喉頭頸外科

劉宏俠 lhx1lmq@126.com

孫玉滿 學(xué)士，主治醫(yī)師。專業(yè)方向為腫瘤病理學(xué)。

E-mail：symts@163.com