雍康+張傳師（等）

摘要：為了解奶牛S100A12基因序列的特征及其在乳腺和生殖系統(tǒng)中的表達(dá)情況，采用RT-PCR技術(shù)從奶牛外周血液中擴(kuò)增S100A12基因，重組到pMD19-T Simple載體中，進(jìn)行了測(cè)序和序列分析，并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)（卵巢、輸卵管、子宮頸、子宮體、陰道等組織）中S100A12 mRNA的表達(dá)分布。結(jié)果顯示，克隆的S100A12基因包含一個(gè)279 bp的完整開放閱讀框（ORF），與GenBank中的奶牛S100A12基因（NM_174651）編碼區(qū)序列100%相同，該ORF編碼的92個(gè)氨基酸含有一個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)（位于49-84氨基酸殘基）；另外，還預(yù)測(cè)到3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，分別位于19-21、44-46和70-73氨基酸殘基。S100A12基因在奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)上皮組織中均有表達(dá)。推測(cè)S100A12基因在奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)中具有一定作用。

關(guān)鍵詞：S100A12基因；組織表達(dá)；基因克?。荒膛?/p>

中圖分類號(hào)：S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）07-1616-05

Cloning of Mastitis Resistance-Related Gene S100A12 in Dairy Cow and Its Expression in Lacteal Gland and Genital System

YONG Kang1， ZHANG Chuan-shi1， YANG Qing-wen1，YAO Xue-ping2，CAO Sui-zhong2

（1.Department of Animal Science and Technology，Chongqing Three Gorges Vocational College， Chongqing 404155， China；

2. College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Yaan 625014，Sichuan，China）

Abstract： To study the characteristics of dairy cow S100A12 gene and its expression in lacteal gland and genital system， the S100A12 gene was amplified by RT-PCR from peripheral blood of dairy cow and sequenced and analyzed after recombination in pMD19-T Simple vector. The expression distributions of S100A12 mRNA in dairy cows lacteal gland and genital system were detected by RT-PCR. The results showed that the cloned S100A12 gene had a 270bp ORF， 100% identical with S100A12 gene in GenBank. In ORF， there was a EF hand formation consisted of 92 amino acids（49-84 amino acids residue）. Three phosphorylation sites of protein kinase C were found in 19-21， 44-46， 70-73 amino acid residues. S100A12 gene was expressed in all epithelial tissue of dairy cow lacteal gland and genital system. It might play an important role in dairy cow lacteal gland and genital system.

Key words： S100A12 gene； tissue expression； gene clone； cow

奶牛乳房炎是影響世界奶牛業(yè)發(fā)展、給乳品生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的一種常見病和多發(fā)病，研究奶牛乳房炎抗性的分子機(jī)理，尋找出調(diào)控乳房炎抗性的關(guān)鍵或重要的基因及其信號(hào)通路，則可以通過營(yíng)養(yǎng)調(diào)控、開發(fā)新藥治療和遺傳選育等各種策略提高乳房炎抗性，降低乳房炎的發(fā)生率[1]。血液白細(xì)胞在奶牛乳腺免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，乳房炎的發(fā)生與乳腺的免疫密切相關(guān)，而奶牛乳腺免疫是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，白細(xì)胞中大量相關(guān)基因以直接或間接的方式參與乳腺免疫[2]，這些因子中就包括S100A12。S100A12是1994年在豬粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的[3]。S100A12蛋白與大多數(shù)S100家族蛋白一樣，具有較低的相對(duì)分子質(zhì)量和兩個(gè)EF-手型鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域[4]，以共價(jià)二聚體的形式存在，蛋白由兩個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)組成，EF手型結(jié)構(gòu)又由具有高親和性和選擇性結(jié)合于鈣離子的螺旋-環(huán)-螺旋配基組成，兩側(cè)為疏水區(qū)，中央為鉸鏈區(qū)[5]。N端由14個(gè)氨基酸組成，呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與鈣離子的親和性低，C端則通常由12個(gè)氨基酸組成，并與鈣離子具有較高的親和性[6]。S100A12正常表達(dá)于中性粒細(xì)胞，同時(shí)在淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞中有低豐度表達(dá)[7]。當(dāng)與鈣離子結(jié)合后，S100A12蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出與靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而通過與相應(yīng)的靶蛋白作用發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。因此，S100蛋白被認(rèn)為是一種鈣傳感器蛋白，通過鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)途徑在細(xì)胞增殖、分化、肌肉收縮、基因表達(dá)、分泌及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[8]。S100A12具有上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子、活化炎性細(xì)胞、趨化特性和抗菌活性等功能 [9]。S100A12與RAGE結(jié)合后通過NF-kB和MAP激酶信號(hào)通路直接引起內(nèi)皮細(xì)胞、單核吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化，結(jié)果導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的合成和分泌[10]，在機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

本研究以奶牛外周血白細(xì)胞為材料，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)獲得了S100A12基因，擬通過分子克隆和生物信息學(xué)分析，為深入研究奶牛乳房炎抗性的分子機(jī)理提供重要的線索，為基因診斷、抗性育種提供新的資料。并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)（卵巢、輸卵管、子宮頸、子宮體、陰道等組織）中S100A12 mRNA的表達(dá)分布，為探索控制奶牛乳房炎抗性的分子遺傳機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 成年4～5歲健康奶牛，由四川省雅安市雨城區(qū)多營(yíng)屠宰場(chǎng)提供。屠宰前頸靜脈無菌采血10 mL，4 000 r/min常溫離心10 min，移液槍小心吸取中間白細(xì)胞層置于5 mL RNA store樣品保存液中混勻，4 ℃保存。屠宰后，立即采集乳腺、陰道、子宮頸、子宮體、輸卵管和卵巢等組織，分別剪成小塊，用RNA store 4 ℃浸泡過夜后-20 ℃冷凍保存?；既榉垦啄膛５娜橄俳M織由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室自存。

1.1.2 菌株、克隆載體及試劑 克隆宿主菌E.coli DH5α、RNA store樣品保存液、RNA simple總RNA抽提試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA Marker均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；pMDTM19-T Simple Vector、TaKaRa Prime Script RT-PCR Kit、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH I為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中已有的牛S100A12基因序列（NM_174651）以及酶切位點(diǎn)，借助計(jì)算機(jī)軟件Oligo6.0Primer primer 5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，上游引物P1：5′-CCGGATCCACTAAGCTGGAAGATCACCTGGAGG-3′；下游引物P2：5′- CCAAGCTTTACTCTTTG TGGATATCTATGTGGGCTG-3′，5′端分別添加BamH I、Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)（下劃線部分）；由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 中國(guó)荷斯坦奶牛外周血總RNA的抽提 取20 mL外周血，按總RNA抽提試劑盒說明書提取各組織總RNA。

1.2.3 RT-PCR反應(yīng)和cDNA擴(kuò)增 參照TaKaRa Prime Script RT-PCR Kit說明書操作合成cDNA第一鏈。RT反應(yīng)體系包括10 mmol/L dNTP Mixture 1 μL，Oligo dT Primer（2.5 μmol/L）1 μL，總RNA 2.5 μL，RNase Free ddH2O補(bǔ)至10 μL，在PCR儀上進(jìn)行變性、退火反應(yīng)（65 ℃ 5 min）。然后在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：5×PrimeScriptTM Buffer 4 μL，RNase Inhibitor （40 U/μL） 0.5 μL，PrimeScriptTM RTase（for 2 step） 0.5 μL，RNase Free ddH2O 5 μL，在PCR儀上按42 ℃ 30 min退火延伸，95 ℃ 5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活，4 ℃保存，合成cDNA第一鏈。PCR擴(kuò)增S100A12基因采用20 μL體系：上述的RT反應(yīng)液1 μL，dNTP Mixture （10 mmol/L） 10 μL，上、下游PCR引物各1 μL，RNase Free ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃保持10 min；4 ℃保存。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物與pMD19-T Simple載體的連接 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化后，與載體連接。按pMD19-T Simple載體試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系10 μL：Solution 5 μL，pMDl9-T Simple載體1 μL，PCR純化產(chǎn)物3 μL，無菌ddH2O補(bǔ)足至10 μL，混勻后16 ℃連接30 min，連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。

1.2.5 酶切鑒定及測(cè)序 挑取單個(gè)白色菌落，接種于5 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒經(jīng)BamH I+Hind Ⅲ雙酶切，鑒定正確的質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)得序列用DNAStar軟件進(jìn)行序列分析并用Blast進(jìn)行同源性比較。

1.2.6 S100A12在奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)中的表達(dá)分析 取凍存的健康奶牛乳腺、卵巢、輸卵管、子宮頸、子宮體、陰道和患乳房炎奶牛乳腺組織各100 mg，分別提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，方法同“1.2.2”與“1.2.3”。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛S100A12基因的克隆及重組質(zhì)粒的酶切鑒定

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在287 bp處均出現(xiàn)一條DNA條帶，與預(yù)期的產(chǎn)物長(zhǎng)度吻合（圖1A），表明本試驗(yàn)成功地完成了總RNA的抽提與S100A12 cDNA的RT-PCR擴(kuò)增。陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ+BamH I雙酶切鑒定，獲得約2 700 bp（T克隆載體）與287 bp的DNA條帶（圖1 B）。結(jié)果與預(yù)期的片段大小相符，證實(shí)目的片段已插入T-載體。

2.2 DNA序列分析

將陽性克隆質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果用Blast進(jìn)行同源性比較，與GenBank中的奶牛S100A12基因編碼區(qū)序列100%相同，包含279 bp（除去內(nèi)含子）的S100A12基因完整開放閱讀框（ORF），推導(dǎo)該序列編碼92個(gè)氨基酸（圖2）。表明克隆所獲得的基因片段為預(yù)期的奶牛S100A12序列。

奶牛S100A12基因與其他哺乳動(dòng)物S100基因序列同源性的比較結(jié)果（表1）顯示，奶牛S100A12基因與豬S100A12基因的同源性最高，為85.7%，其次是猿猴和人，其同源性分別為77.5%、77.2%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，奶牛S100A12基因除了與奶牛S100A9、S100A4、S100A2基因的同源性較高（同源性分別為61.2%、59.5%、59.2%）以外，與奶牛其他S100基因同源性都不高，其中與奶牛S100A11基因的同源性最低（29.4%）。

奶牛S100A12基因與人及其他哺乳動(dòng)物S100 cDNA全序列的生物進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖3）顯示，奶牛S100A12基因與人、猿猴S100A12基因親緣關(guān)系最近，三者構(gòu)成親緣關(guān)系相近的一個(gè)分支；其次親緣關(guān)系較近的是豬S100A12基因；另外與奶牛S100A8基因的親緣關(guān)系也比較近，構(gòu)成了一個(gè)較小的分支。

利用ExPASy的ProtParam軟件分析，相對(duì)分子質(zhì)量為10 575，理論等電點(diǎn)為5.67，利用蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫PROSITE對(duì)奶牛S100A12基因編碼氨基酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)，在49-84位氨基酸之間存在一個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)；另外，還預(yù)測(cè)到3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，分別位于19-21、44-46和70-73氨基酸殘基（圖2）。

2.3 S100A12在奶牛乳腺和生殖器官中的表達(dá)

從奶牛乳腺和生殖器官（輸卵管、卵巢、子宮頸、子宮體、陰道）組織中擴(kuò)增出了S100A12基因（圖4），表明S100A12基因在奶牛的輸卵管、卵巢、子宮頸、子宮體、陰道和乳腺中均有表達(dá)。

3 討論

奶牛乳房炎抗性是一個(gè)極為復(fù)雜的功能。長(zhǎng)期以來，雖然對(duì)奶牛乳房炎抗性的機(jī)理進(jìn)行了大量研究，但是迄今為止對(duì)有關(guān)乳房炎抗性的分子機(jī)理并不十分清楚，因此進(jìn)一步篩選和克隆與乳房炎抗性相關(guān)的基因并進(jìn)行基因功能分析對(duì)深入了解乳房炎抗性的分子機(jī)理具有重要的意義[11]。

Lutzow等[12]通過轉(zhuǎn)錄分析牛奶中基因表達(dá)的變化，用不同劑量金黃色葡萄球菌感染3頭奶牛乳房不同乳區(qū)，發(fā)現(xiàn)乳腺組織中S100A12基因表達(dá)加強(qiáng)，在感染乳區(qū)的牛奶中該基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)水平顯著（P<0.01）提高。Mitterhuemer等[13]將大腸桿菌灌入奶牛乳房后發(fā)現(xiàn)，感染乳區(qū)和相鄰未感染乳區(qū)牛奶中S100A12蛋白含量分別比正常牛奶中該蛋白含量高出110倍、4倍。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，Smolenski等[14]確定了S100鈣結(jié)合蛋白3個(gè)家庭成員（S100A12、S100A11、S100A9）存在于患乳房炎奶牛的牛奶中，但在泌乳高峰期的牛奶或初乳中并沒有發(fā)現(xiàn)這3種蛋白。據(jù)此推測(cè)，牛奶中存在的天然免疫蛋白可能決定了乳腺組織的敏感度及抗感染能力。Lippolis等[15]在奶牛嗜中性粒細(xì)胞中鑒定出了包括鈣結(jié)合蛋白S100A12、S100A9在內(nèi)的250個(gè)蛋白，并將S100A12、S100A9歸類到具有抗菌活性的免疫蛋白組中。曹隨忠[11]利用反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)健康奶牛和患乳房炎奶牛外周血液白細(xì)胞中差異基因進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S100A12基因出現(xiàn)的頻率最高，據(jù)此推測(cè)S100A12蛋白可能在奶牛防御乳房炎病原菌感染中發(fā)揮重要作用。周雷[16]利用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)健康奶牛與患乳房炎奶牛外周白細(xì)胞中基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，S100A12等4種基因在奶牛乳房炎時(shí)高度表達(dá)。充足的證據(jù)表明，白細(xì)胞在奶牛乳腺免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，奶牛乳房炎的發(fā)生與奶牛乳腺免疫密切相關(guān)，研究患乳房炎奶牛與健康奶牛血液白細(xì)胞中基因的差異表達(dá)可能是鑒定乳房炎抗性相關(guān)基因的關(guān)鍵[11]。

本研究中克隆的奶牛S100A12基因編碼92個(gè)氨基酸，其cDNA序列與人、豬、猿猴和奶牛其他S100基因進(jìn)化樹的分析結(jié)果顯示，奶牛與人、豬、猿猴S100A12基因親緣關(guān)系比較近，說明S100A12基因的表達(dá)具有種屬特異性。奶牛、人、豬、猿猴S100A12基因與奶牛S100A8基因之間的關(guān)系也較近，形成了1個(gè)小的分支。

細(xì)胞外S100A12蛋白可以促發(fā)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）、蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）、鈣離子流出、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ、絲裂原激活蛋白激酶的激酶（MEK）等途徑，人類S100A12的表達(dá)需要PKC的激活[17]。在LPS刺激下能激活PKC并能引起S100A12蛋白的分泌[18]。經(jīng)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)S100A12基因的編碼蛋白中含有3個(gè)PKC磷酸化位點(diǎn)（圖2）。因此，PKC可能在奶牛S100A12 mRNA和蛋白水平上提供基本的開關(guān)作用。PKC和蛋白激酶A（PKA）以及Ca2+有助于哺乳動(dòng)物肝臟、單核細(xì)胞和海馬神經(jīng)細(xì)胞對(duì)C/EBPb mRNA的表達(dá)[19]。鈣離子作為一種普遍的第二信使在很多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要的作用，在細(xì)胞內(nèi)，有許多鈣結(jié)合蛋白將這種信號(hào)再轉(zhuǎn)變成為瞬時(shí)信號(hào)從而產(chǎn)生一系列的生化反應(yīng)。這類鈣結(jié)合蛋白家族都具有一種鈣結(jié)合區(qū)域即EF手型結(jié)構(gòu)（EF-hand），每個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)包括含E、F兩段螺旋，并形成螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)[5]。本研究通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)S100A12基因編碼的蛋白中含有一個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)（位于49-84氨基酸殘基）。

由于乳腺和生殖系統(tǒng)的特殊生理功能，上皮組織是構(gòu)成乳腺和整個(gè)生殖道防御外界病原微生物的主要屏障，決定了以中性粒細(xì)胞為主要組成的先天性免疫防御系統(tǒng)抵御病原微生物入侵的重要地位，而S100A12是中性粒細(xì)胞中的關(guān)鍵分子[3]，在發(fā)生炎癥時(shí)顯著表達(dá)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S100A12在奶牛輸卵管、卵巢、子宮頸、子宮體、陰道、乳腺中均有表達(dá)。筆者推測(cè)S100A12可能通過募集中性粒細(xì)胞來擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，這種基因在抵御乳房炎方面起著重要的作用。

不同生理狀態(tài)下的S100A12基因在乳腺和生殖系統(tǒng)中的表達(dá)不同，炎癥時(shí)表達(dá)量顯著增高。Buhimschi等[20]運(yùn)用蛋白質(zhì)組技術(shù)對(duì)羊水的研究表明，鈣粒蛋白C在內(nèi)的4個(gè)生物分子可用于檢測(cè)子宮內(nèi)感染炎癥的狀態(tài)。Wathes等[21]研究證實(shí)，奶牛在產(chǎn)后2周內(nèi)，子宮中S100A12、S100A8、S100A9等抗性基因明顯上調(diào)。Buhimschi等[22，23]首次通過SELDL-TOF質(zhì)譜技術(shù)證實(shí)了S100A12和S100A8在懷孕和未孕婦女子宮頸中的存在，并推測(cè)生物標(biāo)記的S100A8和S100A12是子宮頸陰道分泌物的組成部分，參與機(jī)體的防御系統(tǒng)，很可能對(duì)上行性感染提供持久保護(hù)。楊永新等[24]研究發(fā)現(xiàn)鈣粒蛋白C類似物在臨床型乳房炎奶牛乳腺組織中表達(dá)量增加，據(jù)此推測(cè)，鈣粒蛋白C類似物也具有活化吞噬細(xì)胞遷移到組織炎癥位點(diǎn)的作用。Buitenhuis等[25]對(duì)兩頭奶牛乳腺人工感染大腸桿菌24 h后基因表達(dá)分析得知，相對(duì)于健康奶牛乳腺組織，其S100A2、S100A8、S100A9和S100A12四種基因重復(fù)上調(diào)。

在本試驗(yàn)中，S100A12在奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，與其參與乳腺和生殖系統(tǒng)天然免疫防御密切相關(guān)，推測(cè)其在抵御奶牛乳腺和生殖系統(tǒng)感染中起著至關(guān)重要的作用。

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