趙文娟，徐升運(yùn)（等）

摘要：研究了一株產(chǎn)紡織用中性蛋白酶MYS11菌株的培養(yǎng)基組成。結(jié)果表明，該菌株的發(fā)酵最適條件為碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵條件，即培養(yǎng)基起始pH 6.8、接種量6%、發(fā)酵時(shí)間54 h、發(fā)酵溫度36 ℃。在最適條件下，MYS11菌株產(chǎn)酶活力達(dá)到1 884 U/mL，明顯高于優(yōu)化前水平。

關(guān)鍵詞：紡織；中性蛋白酶；菌株；發(fā)酵條件

中圖分類號(hào)：Q814.1；TS136 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）07-1641-04

Optimizing the Fermentation Conditions of the MYS11 Strain Producing Neutral Protease for the Textiles

ZHAO Wen-juan1，XU Sheng-yun1，MA Qi2，REN Ping2，QIN Tao1

（1.Institute of Enzyme Engineering，Shaanxi Academy of Sciences， Xian 710600，China；

2.Shaanxi Engineering Center for Enzyme Technology， Xian 710600，China）

Abstract： The fermentation medium of a MYS11 strain producing neutral protease for the textiles were studied. The results showed that the optimal medium was consisted of the carbon source 3% corn powder， the nitrogen source 1% soyabean protein powder， and 0.2% KH2PO4. The fermentation conditions were optimized by the orthogonal experiment. The optimum culture were initial pH 6.8， inoculation volume 6%， the time 54 h and the temperature 36 ℃. Under the optimal conditions， the activity of neutral protease from MYS11 reached 1 884 U/mL， increased obviously than before the optimization.

Key words： textiles； neutral protease； strain； fermentation condition

中性蛋白酶是應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑之一，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、紡織、洗滌、皮革脫毛軟化、畜禽血液蛋白質(zhì)水解、果酒啤酒和飲料的澄清以及醫(yī)學(xué)治療等應(yīng)用領(lǐng)域中[1-5]。在紡織行業(yè)中應(yīng)用中性蛋白酶進(jìn)行紡織品整理以及毛織物防氈縮處理，具有廣泛的應(yīng)用前景，已成為研究的熱點(diǎn)[6，7]。但是中性蛋白酶的發(fā)酵單位一直很低，使用成本高，導(dǎo)致該蛋白酶在紡織上應(yīng)用受到較大的影響，如何提高中性蛋白酶的發(fā)酵單位，成為酶制劑發(fā)酵中的難題，其中培養(yǎng)基的組成及發(fā)酵條件對(duì)中性蛋白酶的產(chǎn)生起著決定性的作用。因此，本研究對(duì)產(chǎn)紡織用中性蛋白酶的菌株MYS11的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，分析產(chǎn)酶變化，以提高菌株產(chǎn)酶能力。

1 材料與方法

1.1 菌種

MYS11是陜西省科學(xué)院酶工程研究所從土壤中分離得到的產(chǎn)紡織用中性蛋白酶菌株。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：L-Tyrosine（酪氨酸）（Sigma公司）；干酪素（酪蛋白）（上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司）；其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為去離子水。

儀器：UV-640型紫外分光光度計(jì)、恒溫調(diào)速搖瓶柜、高速冷凍離心機(jī)、水浴鍋等。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：牛肉膏0.5%，蛋白胨0.6%，NaCl 0.5%，pH 7.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：可溶性淀粉3%，蛋白胨1%，KH2PO4 0.1%，K2HPO4 0.1%，MgCl2 0.1%，pH 7.0。

1.4 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別測(cè)定濃度為0、10、20、30、40、50 μg/mL酪氨酸在波長(zhǎng)680 nm處的吸光度，根據(jù)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

1.5 中性蛋白酶活力測(cè)定

粗酶液的制備：在35 ℃條件下，接種量為5%（V/V），發(fā)酵48 h，取發(fā)酵液用4層紗布過濾制備粗酶液，用于測(cè)定中性蛋白酶的活力。

發(fā)酵液酶活力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[8]。1 g固體酶粉（或1 mL液體酶）在一定溫度和pH下，1 min 水解酪蛋白產(chǎn)生1 ？滋g酪氨酸，即為一個(gè)酶活力單位，以U/mL（U/g）表示。

X=A×k×4/10×n

式中X為樣品酶活力，U/mL（U/g）；A為平均吸光度；k為吸光常數(shù)；4為反應(yīng)試劑的總體積（mL）；10為反應(yīng)時(shí)間10 min，以1 min計(jì)；n為稀釋倍數(shù)。

1.6 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

對(duì)培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機(jī)鹽進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)產(chǎn)酶活力的變化確定發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。①碳源：將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的3%可溶性淀粉（對(duì)照），分別用相同含量的葡萄糖、果糖、麥芽糖、玉米淀粉、乳糖、玉米粉和麩皮進(jìn)行替換，其他成分和含量不變，按“1.5”的方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液中性蛋白酶的活力，以初始發(fā)酵培養(yǎng)基的酶活力作為對(duì)照，確定最佳碳源；②氮源：以3%玉米粉為碳源，將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的1%蛋白胨（對(duì)照），分別用相同含量的大豆蛋白粉、牛肉膏、酵母膏、尿素、硝酸銨和豆餅粉替換，其他操作同上，確定最佳氮源；③無機(jī)鹽：確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源、氮源，再將初始培養(yǎng)基中0.1%KH2PO4+0.1%K2HPO4（對(duì)照）的無機(jī)鹽替換為總量是0.2%的KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4、KCl、ZnCl2、FeCl2，其他操作同上，選擇適宜的無機(jī)鹽。

1.7 單因素試驗(yàn)

研究培養(yǎng)基起始pH、接種量、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響。①培養(yǎng)基起始pH。用0.2 mol/L NaOH或HCl將發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH分別調(diào)為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在“1.6”篩選的培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定中性蛋白酶酶活力；②接種量。在篩選培養(yǎng)基起始pH的基礎(chǔ)上，將種子培養(yǎng)液按 4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%分別進(jìn)行接種發(fā)酵，測(cè)定中性蛋白酶酶活力；③發(fā)酵時(shí)間。在培養(yǎng)基起始pH、接種量篩選的基礎(chǔ)上，以12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h不同時(shí)間段進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定中性蛋白酶酶活力；④發(fā)酵溫度。在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在28、30、32、34、36、38、40 ℃的溫度下，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定中性蛋白酶酶活力。

1.8 發(fā)酵條件的優(yōu)化

以上述單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以培養(yǎng)基起始pH、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度為因子，進(jìn)行3因素3水平正交L9（33）試驗(yàn)，每個(gè)處理3次重復(fù)，優(yōu)化發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。通過圖1的線性相關(guān)性可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，計(jì)算得到蛋白酶活力公式中的常數(shù)k=96.91，在標(biāo)準(zhǔn)要求的95～100之間，因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足應(yīng)用的要求，是可行的。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

2.2.1 最適碳源的確定 從圖2可以看出，以玉米粉、果糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源時(shí)，中性蛋白酶酶活力都高于對(duì)照可溶性淀粉，以玉米粉為碳源時(shí)發(fā)酵液中性蛋白酶酶活力最高，達(dá)到1 380 U/mL，因此確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源為玉米粉。

2.2.2 最適氮源的確定 由圖3 可以看出，以大豆蛋白粉、牛肉膏為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源時(shí)，發(fā)酵液中性蛋白酶酶活力都高于對(duì)照，其中以大豆蛋白粉為氮源時(shí)發(fā)酵液酶活力最高，達(dá)到1 460 U/mL。因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源為大豆蛋白粉。

2.2.3 無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖4可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中添加不同的無機(jī)鹽，對(duì)產(chǎn)酶的影響不同，其中添加0.2%的KCl、ZnCl2、FeCl2不利于產(chǎn)酶，而添加0.2% KH2PO4對(duì)產(chǎn)酶最有利，因此選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2% KH2PO4。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)基起始pH在5.0～7.0之間時(shí)菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力不斷增加；發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH大于7.0時(shí)，中性蛋白酶酶活力下降，因此培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶影響較大。當(dāng)培養(yǎng)基起始pH在7.0左右時(shí)對(duì)產(chǎn)酶最為有利，所以確定培養(yǎng)基起始pH為7.0。

2.3.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖6可知，接種量的不同對(duì)菌株產(chǎn)中性蛋白酶也有一定的影響，當(dāng)接種量在4%～6%時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而增大；當(dāng)接種量大于6%時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而減小，因此確定接種量為6%。

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖7可知，在培養(yǎng)48 h時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力達(dá)到峰值，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過48 h時(shí)，中性蛋白酶酶活力隨時(shí)間的延長(zhǎng)而變化不大。因此，確定發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.3.4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖8可知，當(dāng)發(fā)酵溫度小于36 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而增加；當(dāng)溫度大于36 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而降低。因此，確定發(fā)酵溫度為36 ℃。

2.3.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件的結(jié)果見表2。由表2可知，對(duì)菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力影響最大的是發(fā)酵時(shí)間，其次是培養(yǎng)基起始pH，最后是發(fā)酵溫度。綜合考慮，得出菌株產(chǎn)中性蛋白酶培養(yǎng)基最佳發(fā)酵條件為A3B2C1，即發(fā)酵時(shí)間為54 h、培養(yǎng)基起始pH 6.8、發(fā)酵溫度36 ℃，得到的發(fā)酵液產(chǎn)中性蛋白酶酶活力達(dá)1 884 U/mL。

3 小結(jié)

通過對(duì)產(chǎn)中性蛋白酶的MYS11菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機(jī)鹽進(jìn)行研究，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。采用正交試驗(yàn)優(yōu)化后的發(fā)酵條件為培養(yǎng)基起始pH 6.8、接種量為6%、發(fā)酵時(shí)間為54 h、發(fā)酵溫度36 ℃。產(chǎn)中性蛋白酶的MYS11菌株在最適發(fā)酵條件及培養(yǎng)基組成下，其產(chǎn)酶活性達(dá)到1 884 U/mL，與優(yōu)化前相比有明顯的提高，作為原始野生菌株通過誘變篩選，可進(jìn)一步提高產(chǎn)酶能力，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

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[8] QB/T 1803—1993，工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法[S].

1.7 單因素試驗(yàn)

研究培養(yǎng)基起始pH、接種量、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響。①培養(yǎng)基起始pH。用0.2 mol/L NaOH或HCl將發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH分別調(diào)為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在“1.6”篩選的培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定中性蛋白酶酶活力；②接種量。在篩選培養(yǎng)基起始pH的基礎(chǔ)上，將種子培養(yǎng)液按 4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%分別進(jìn)行接種發(fā)酵，測(cè)定中性蛋白酶酶活力；③發(fā)酵時(shí)間。在培養(yǎng)基起始pH、接種量篩選的基礎(chǔ)上，以12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h不同時(shí)間段進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定中性蛋白酶酶活力；④發(fā)酵溫度。在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在28、30、32、34、36、38、40 ℃的溫度下，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定中性蛋白酶酶活力。

1.8 發(fā)酵條件的優(yōu)化

以上述單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以培養(yǎng)基起始pH、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度為因子，進(jìn)行3因素3水平正交L9（33）試驗(yàn)，每個(gè)處理3次重復(fù)，優(yōu)化發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。通過圖1的線性相關(guān)性可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，計(jì)算得到蛋白酶活力公式中的常數(shù)k=96.91，在標(biāo)準(zhǔn)要求的95～100之間，因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足應(yīng)用的要求，是可行的。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

2.2.1 最適碳源的確定 從圖2可以看出，以玉米粉、果糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源時(shí)，中性蛋白酶酶活力都高于對(duì)照可溶性淀粉，以玉米粉為碳源時(shí)發(fā)酵液中性蛋白酶酶活力最高，達(dá)到1 380 U/mL，因此確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源為玉米粉。

2.2.2 最適氮源的確定 由圖3 可以看出，以大豆蛋白粉、牛肉膏為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源時(shí)，發(fā)酵液中性蛋白酶酶活力都高于對(duì)照，其中以大豆蛋白粉為氮源時(shí)發(fā)酵液酶活力最高，達(dá)到1 460 U/mL。因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源為大豆蛋白粉。

2.2.3 無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖4可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中添加不同的無機(jī)鹽，對(duì)產(chǎn)酶的影響不同，其中添加0.2%的KCl、ZnCl2、FeCl2不利于產(chǎn)酶，而添加0.2% KH2PO4對(duì)產(chǎn)酶最有利，因此選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2% KH2PO4。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)基起始pH在5.0～7.0之間時(shí)菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力不斷增加；發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH大于7.0時(shí)，中性蛋白酶酶活力下降，因此培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶影響較大。當(dāng)培養(yǎng)基起始pH在7.0左右時(shí)對(duì)產(chǎn)酶最為有利，所以確定培養(yǎng)基起始pH為7.0。

2.3.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖6可知，接種量的不同對(duì)菌株產(chǎn)中性蛋白酶也有一定的影響，當(dāng)接種量在4%～6%時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而增大；當(dāng)接種量大于6%時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而減小，因此確定接種量為6%。

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖7可知，在培養(yǎng)48 h時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力達(dá)到峰值，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過48 h時(shí)，中性蛋白酶酶活力隨時(shí)間的延長(zhǎng)而變化不大。因此，確定發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.3.4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖8可知，當(dāng)發(fā)酵溫度小于36 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而增加；當(dāng)溫度大于36 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而降低。因此，確定發(fā)酵溫度為36 ℃。

2.3.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件的結(jié)果見表2。由表2可知，對(duì)菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力影響最大的是發(fā)酵時(shí)間，其次是培養(yǎng)基起始pH，最后是發(fā)酵溫度。綜合考慮，得出菌株產(chǎn)中性蛋白酶培養(yǎng)基最佳發(fā)酵條件為A3B2C1，即發(fā)酵時(shí)間為54 h、培養(yǎng)基起始pH 6.8、發(fā)酵溫度36 ℃，得到的發(fā)酵液產(chǎn)中性蛋白酶酶活力達(dá)1 884 U/mL。

3 小結(jié)

通過對(duì)產(chǎn)中性蛋白酶的MYS11菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機(jī)鹽進(jìn)行研究，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。采用正交試驗(yàn)優(yōu)化后的發(fā)酵條件為培養(yǎng)基起始pH 6.8、接種量為6%、發(fā)酵時(shí)間為54 h、發(fā)酵溫度36 ℃。產(chǎn)中性蛋白酶的MYS11菌株在最適發(fā)酵條件及培養(yǎng)基組成下，其產(chǎn)酶活性達(dá)到1 884 U/mL，與優(yōu)化前相比有明顯的提高，作為原始野生菌株通過誘變篩選，可進(jìn)一步提高產(chǎn)酶能力，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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[8] QB/T 1803—1993，工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法[S].

1.7 單因素試驗(yàn)

研究培養(yǎng)基起始pH、接種量、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力的影響。①培養(yǎng)基起始pH。用0.2 mol/L NaOH或HCl將發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH分別調(diào)為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在“1.6”篩選的培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定中性蛋白酶酶活力；②接種量。在篩選培養(yǎng)基起始pH的基礎(chǔ)上，將種子培養(yǎng)液按 4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%分別進(jìn)行接種發(fā)酵，測(cè)定中性蛋白酶酶活力；③發(fā)酵時(shí)間。在培養(yǎng)基起始pH、接種量篩選的基礎(chǔ)上，以12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h不同時(shí)間段進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定中性蛋白酶酶活力；④發(fā)酵溫度。在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在28、30、32、34、36、38、40 ℃的溫度下，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定中性蛋白酶酶活力。

1.8 發(fā)酵條件的優(yōu)化

以上述單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以培養(yǎng)基起始pH、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度為因子，進(jìn)行3因素3水平正交L9（33）試驗(yàn)，每個(gè)處理3次重復(fù)，優(yōu)化發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。通過圖1的線性相關(guān)性可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，計(jì)算得到蛋白酶活力公式中的常數(shù)k=96.91，在標(biāo)準(zhǔn)要求的95～100之間，因此該標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足應(yīng)用的要求，是可行的。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

2.2.1 最適碳源的確定 從圖2可以看出，以玉米粉、果糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源時(shí)，中性蛋白酶酶活力都高于對(duì)照可溶性淀粉，以玉米粉為碳源時(shí)發(fā)酵液中性蛋白酶酶活力最高，達(dá)到1 380 U/mL，因此確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源為玉米粉。

2.2.2 最適氮源的確定 由圖3 可以看出，以大豆蛋白粉、牛肉膏為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源時(shí)，發(fā)酵液中性蛋白酶酶活力都高于對(duì)照，其中以大豆蛋白粉為氮源時(shí)發(fā)酵液酶活力最高，達(dá)到1 460 U/mL。因此，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最適氮源為大豆蛋白粉。

2.2.3 無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖4可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中添加不同的無機(jī)鹽，對(duì)產(chǎn)酶的影響不同，其中添加0.2%的KCl、ZnCl2、FeCl2不利于產(chǎn)酶，而添加0.2% KH2PO4對(duì)產(chǎn)酶最有利，因此選擇在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2% KH2PO4。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)基起始pH在5.0～7.0之間時(shí)菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力不斷增加；發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH大于7.0時(shí)，中性蛋白酶酶活力下降，因此培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶影響較大。當(dāng)培養(yǎng)基起始pH在7.0左右時(shí)對(duì)產(chǎn)酶最為有利，所以確定培養(yǎng)基起始pH為7.0。

2.3.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖6可知，接種量的不同對(duì)菌株產(chǎn)中性蛋白酶也有一定的影響，當(dāng)接種量在4%～6%時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而增大；當(dāng)接種量大于6%時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨接種量的增加而減小，因此確定接種量為6%。

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖7可知，在培養(yǎng)48 h時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力達(dá)到峰值，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過48 h時(shí)，中性蛋白酶酶活力隨時(shí)間的延長(zhǎng)而變化不大。因此，確定發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.3.4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響 由圖8可知，當(dāng)發(fā)酵溫度小于36 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而增加；當(dāng)溫度大于36 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力隨溫度的升高而降低。因此，確定發(fā)酵溫度為36 ℃。

2.3.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件的結(jié)果見表2。由表2可知，對(duì)菌株產(chǎn)中性蛋白酶酶活力影響最大的是發(fā)酵時(shí)間，其次是培養(yǎng)基起始pH，最后是發(fā)酵溫度。綜合考慮，得出菌株產(chǎn)中性蛋白酶培養(yǎng)基最佳發(fā)酵條件為A3B2C1，即發(fā)酵時(shí)間為54 h、培養(yǎng)基起始pH 6.8、發(fā)酵溫度36 ℃，得到的發(fā)酵液產(chǎn)中性蛋白酶酶活力達(dá)1 884 U/mL。

3 小結(jié)

通過對(duì)產(chǎn)中性蛋白酶的MYS11菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機(jī)鹽進(jìn)行研究，確定發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為碳源3%玉米粉、氮源1%大豆蛋白粉、添加0.2%KH2PO4。采用正交試驗(yàn)優(yōu)化后的發(fā)酵條件為培養(yǎng)基起始pH 6.8、接種量為6%、發(fā)酵時(shí)間為54 h、發(fā)酵溫度36 ℃。產(chǎn)中性蛋白酶的MYS11菌株在最適發(fā)酵條件及培養(yǎng)基組成下，其產(chǎn)酶活性達(dá)到1 884 U/mL，與優(yōu)化前相比有明顯的提高，作為原始野生菌株通過誘變篩選，可進(jìn)一步提高產(chǎn)酶能力，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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