潘春梅+李領(lǐng)川+王靜

摘要：利用3因素5水平的中心組合試驗設(shè)計優(yōu)化了玉米秸稈的纖維素酶水解條件，以提高纖維素氫氣的產(chǎn)量。結(jié)果表明，酶解溫度、pH和酶用量對氫氣產(chǎn)量具有顯著影響。在酶解溫度51.8 ℃，pH 4.84、酶用量9.00 FPU/g TS 條件下，氫氣產(chǎn)量達到208.1 mL/g TVS。通過分析玉米秸稈在降解過程中的成分變化，發(fā)現(xiàn)玉米秸稈經(jīng)水解后纖維素和半纖維素被降解，產(chǎn)氫菌主要利用其產(chǎn)生的可溶性糖發(fā)酵產(chǎn)氫，且混合產(chǎn)氫菌也具有直接降解纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫的能力。

關(guān)鍵詞：玉米秸稈；酶解；纖維素；氫氣；響應(yīng)面法

中圖分類號：S216.2；TQ920.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1645-04

Optimizing Enzymatic Hydrolysis Conditions of Cornstalk for Hydrogen Fermentation by Response Surface Methodology

PAN Chun-mei1， LI Ling-chuan2， WANG Jing1

（1.Biotechnology Department， Henan University of Animal Husbandry Economy， Zhengzhou 450046， China；

2.State-owned Assets Management Deptment， Zhongzhou University， Zhengzhou 450044，China）

Abstract： The cellulosic hydrogen production from cellulase hydrolysis cornstalk was studied using response surface methodology（RSM）. The parameters of process for enzymatic hydrolysis of cornstalk were optimized by a three factor-five level central composite design. The results showed that the optimal parameters of enzymatic hydrolysis of substrate were temperature 51.8 ℃， pH 4.84 and 9.00 FPU/g TS of enzyme loading. The maximum hydrogen yield from cornstalk by anaerobic mixed microflora was 208.1 ml/g TVS under the optimal condition. The hydrogen was attributed to the bioconversion of the generated soluble sugars from the acid-enzymatic hydrolysis of corn stalk. The hydrogen-producing microflora has the ability to directly degrade cellulose to produce hydrogen.

Key words： cornstalk； enzymatic pretreatment； cellulosic；hydrogen； response surface methodology

日益嚴峻的環(huán)境和能源問題使開發(fā)新型可再生清潔能源迫在眉睫[1]。我國秸稈等纖維素類生物質(zhì)資源極為豐富，這些生物質(zhì)資源大多數(shù)被廢棄滯留在環(huán)境中或被焚燒，利用效率低。如將這些纖維素類資源通過發(fā)酵轉(zhuǎn)化為清潔的氫氣能源，對于廢棄資源再生、清潔能源生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境保護具有重要意義。

玉米秸稈等纖維質(zhì)原料具有高度致密性的結(jié)構(gòu)[2]，將其直接轉(zhuǎn)化為能源是相當困難的，原料的高效水解是制約生物能源工業(yè)化的主要瓶頸。纖維素類物質(zhì)的水解可采用物理、化學或生物的方法，目前多種水解方法已應(yīng)用于纖維素氫氣的生產(chǎn)中，如Nguyen等[3]利用離子液處理方法提高了微晶纖維素的氫氣產(chǎn)量，Li等[4]以Clostridium butyricum AS1.209為生產(chǎn)菌種，采用汽爆方式處理秸稈后發(fā)酵產(chǎn)氫；Zhang等[5]將玉米秸稈酸解后，產(chǎn)氫量可提高至149.69 mL/g TVS，與未處理玉米秸稈相比產(chǎn)氫量提高了將近46倍。在眾多的水解方法中，纖維素酶水解方法具有反應(yīng)條件溫和、不生成有毒降解產(chǎn)物、糖得率高和設(shè)備投資低等優(yōu)點，但是目前在生物制氫領(lǐng)域鮮有酶解秸稈產(chǎn)氫的相關(guān)報道。

通過對溫度、pH等酶解關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化可提高纖維素類生物質(zhì)的水解效率，進而增加纖維素氫氣的產(chǎn)量。響應(yīng)面法能用較少的試驗數(shù)據(jù)推算出目標值的優(yōu)化條件，效率高，在微生物發(fā)酵方面已有廣泛應(yīng)用[4，5]。本研究以響應(yīng)面法優(yōu)化秸稈的纖維素酶水解秸稈的條件以獲得最高的氫氣產(chǎn)量，并探討了玉米秸稈降解產(chǎn)氫的機理，以期為玉米秸稈產(chǎn)氫的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

產(chǎn)氫菌源為牛糞堆肥，取自鄭州市奶牛場。玉米秸稈產(chǎn)自鄭州市郊。纖維素酶由寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司提供，纖維素酶酶活力為20 FPU/mL。

1.2 秸稈水解方法

將粉碎至40目的風干玉米秸稈，用1.5% H2SO4浸泡，固液比1∶10（m∶V，下同），121 ℃酸水解1 h，冷卻后用NaOH調(diào)整pH為7.0，然后過濾，在得到的玉米秸稈固體殘渣中加入纖維素酶，用0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液浸泡，固液比1∶20，水解48 h。玉米秸稈酸酶兩步水解得到的所有水解物合并保存在

-20 ℃，用于進一步的分析和發(fā)酵產(chǎn)氫。

分別取原料秸稈（RC）、稀酸處理秸稈（AC）、稀酸-纖維素酶處理秸稈（AEC）和稀酸-纖維素酶處理秸稈產(chǎn)氫后秸稈殘渣（AECH）進行成分分析，其中所加稀酸為1.5% H2SO4，利用Van Soest法測定各處理纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量[6]。

1.3 發(fā)酵產(chǎn)氫

將牛糞堆肥用適量水浸泡，煮沸15 min后，過濾取上清液。在上清液中加入5 g/L蔗糖和5 mL/L營養(yǎng)液，36 ℃厭氧預(yù)培養(yǎng)16 h作為產(chǎn)氫種子液；將1 g秸稈的水解物、2 mL營養(yǎng)液和15 mL 預(yù)培養(yǎng)產(chǎn)氫種子液裝入140 mL批式反應(yīng)器中，用稀酸或稀堿溶液調(diào)節(jié)至初始pH為7.0，用N2吹掃剩余空間的氧氣，用醫(yī)用橡膠塞密封，（36±1） ℃恒溫震蕩。定時檢測產(chǎn)氣量，分析氣相產(chǎn)物中氫氣含量。

1.4 分析方法

采用3，5二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖含量，生物氣中氫氣含量用氣相色譜法測定[1]。按一定時間間隔用排飽和食鹽水法排出發(fā)酵瓶內(nèi)氣體，測量氣體體積。累積產(chǎn)氫量按下述公式計算：

V=V0？酌i+■Vi？酌i

其中，V為累積產(chǎn)氫量（mL）；V0為反應(yīng)器液面上空的體積（mL）；Vi為第i次抽出氣體的體積 （mL）；？酌i為第i次抽出氣體中氫氣含量。在本研究中根據(jù)秸稈的總揮發(fā)性固體TVS（Total volatile solid）將產(chǎn)氫量Ps定義為mL/g TVS。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

采用中心組合試驗設(shè)計對玉米秸稈酶解條件進行3因素5水平的響應(yīng)面分析試驗，以獲得玉米秸稈產(chǎn)氫的最佳酶解條件。以酶解溫度（X1）、pH（X2）、酶用量（X3）為自變量，通過下列公式分別進行編碼轉(zhuǎn)換：

x1=（X1-50）/5

x2=（X2-4.8）/0.4

x3=（X3-8）/3

響應(yīng)面試驗設(shè)計見表1。響應(yīng)面優(yōu)化回歸分析模型為Y =β0 + ∑βi xi +∑βii xi2 + ∑βij xi xj，其中β0、βi、βii和βij分別是截距及回歸系數(shù)，xi、xj是編碼轉(zhuǎn)換后的自變量，響應(yīng)值Y為氫氣產(chǎn)量。響應(yīng)值和自變量之間的關(guān)系利用Minitab 14.1.1軟件進行擬合統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法對玉米秸稈酶解條件的優(yōu)化

中心組合試驗設(shè)計中，不同酶解條件下玉米秸稈的產(chǎn)氫量如表2所示。利用Minitab 14.1.1軟件對玉米秸稈的氫氣產(chǎn)量進行二次多項回歸擬合和數(shù)據(jù)分析，建立最佳玉米秸稈酶解條件的二次響應(yīng)面回歸模型。

由表3可知，擬合的三元二次方程為：

Y1=205.643 +7.562 x1 +1.9 x2 +4.425 x3 -11.92 x12 -8.957 x22 -8.607 x32 -1.875 x1x2 +3.025 x1x3 +2.075 x2x3

其中，x1、x2 和x3分別代表酶解溫度、pH、酶用量的編碼水平，Y1代表氫氣產(chǎn)量預(yù)測值。

對回歸系數(shù)進行檢驗（表3），結(jié)果表明除了酶解溫度和pH的交互作用x1x2氫氣產(chǎn)量不顯著外，其他變量均顯著。酶解溫度x1、pH x2、酶用量x3、酶解溫度的二次項x12、pH的二次項x22和酶用量的二次項x32對氫氣產(chǎn)量Y1有極顯著影響。這說明酶解溫度、pH和酶用量是玉米秸稈酶解的重要控制因素。

對回歸方程進行方差分析（表4），方程的F 值為114.85，相應(yīng)的概率值P<0.001，模型決定系數(shù)R2=0. 993，表明該模型回歸顯著。說明回歸方程對試驗結(jié)果擬合較好，預(yù)測值和實測值之間具有高度的相關(guān)性，可以應(yīng)用于酶解玉米秸稈氫氣產(chǎn)量的理論預(yù)測。

為了求得最佳酶解條件以獲得最高氫氣產(chǎn)量，對所得的回歸擬和方程各自的變量求一階偏導數(shù)，并令其為0，得到三元一次方程組。求解此方程組可以得出模型的極值點：x1 =0.350 8，x2 =0.107 8，x3 =0.331 7，即當酶解溫度為51.8 ℃，pH 4.84、酶用量9.00 FPU/g TS時，理論最大氫氣產(chǎn)量Ps為207.8 mL/g TVS。

根據(jù)獲得的回歸方程，利用Minitab 14.1.1軟件繪制出經(jīng)不同酶解處理的玉米秸稈產(chǎn)氫氣的響應(yīng)面分析圖和等高線圖（圖1）。每個響應(yīng)面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時第三個變量保持在最佳水平。

在酶解溫度和pH對玉米秸稈氫氣產(chǎn)量的影響中，酶用量固定為9.00 FPU/g TS。由圖1A可知，酶解溫度和pH對玉米秸稈的酶解效率有明顯影響，當酶解溫度由40 ℃升至 51.8 ℃、pH由4.0提高至4.84時，氫氣產(chǎn)量急劇增加。當進一步提高溫度和pH，氫氣產(chǎn)量呈下降趨勢。在合適的酶解溫度下，玉米秸稈水解效率提高，秸稈中的纖維素能大量被轉(zhuǎn)化為可溶性糖，導致氫氣產(chǎn)量的增加。

在酶解溫度和酶用量對玉米秸稈氫氣產(chǎn)量的影響中，pH固定為4.84。由圖1B可以看出，酶用量對玉米秸稈氫氣產(chǎn)量的影響也較為明顯。當酶用量和酶解溫度分別由2.00 FPU/g TS和40 ℃提高至9.00 FPU/g TS和51.8 ℃時，氫氣產(chǎn)量達到最大值，之后隨著酶用量和酶解溫度的繼續(xù)增加，氫氣產(chǎn)量反而有所下降。當酶用量過高時產(chǎn)生的高濃度水解產(chǎn)物會對酶系統(tǒng)的催化活性產(chǎn)生抑制作用。由圖1B二維等高線圖可以看出，等高線橢圓的主軸傾斜角很小，說明酶解溫度對氫氣產(chǎn)量的作用要遠遠高于酶用量對氫氣產(chǎn)量的作用。

在pH和酶用量對玉米秸稈氫氣產(chǎn)量的影響中，酶解溫度固定為51.8 ℃。隨著pH和酶用量增加至酶解最佳值pH 4.84、酶用量9.00 FPU/g TS時，氫氣產(chǎn)量逐漸增加至最高值207.8 mL/g TVS，隨后pH和酶用量繼續(xù)增加，氫氣產(chǎn)量則呈減少的趨勢。在二維等高線圖中，當?shù)雀呔€為拉長的連續(xù)的對角橢圓形時，說明兩個因素之間有較為顯著的交互作用[7]。由圖1可以看出酶解的3個因素的等高線圖都呈橢圓形，其交互作用均顯著。

為檢驗?zāi)Ｐ偷臏蚀_性和有效性，在預(yù)測的最佳酶解條件下，對玉米秸稈進行5個平行的酶解處理試驗，然后利用玉米秸稈水解產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)氫氣。搖瓶培養(yǎng)試驗測得的氫氣產(chǎn)量為（208.1±5.8） mL/g TVS（n=5），試驗值與理論預(yù)測值非常接近，可見該模型能較好地預(yù)測酶解處理后玉米秸稈的氫氣發(fā)酵情況。

2.2 降解過程中玉米秸稈成分的變化

稀酸水解、酶水解等多種水解方式都可將玉米秸稈中的纖維素和半纖維素降解為小分子可溶性糖類。表5為原料秸稈（RC）、稀酸處理秸稈（AC）、稀酸-纖維素酶處理秸稈（AEC）和稀酸-纖維素酶處理秸稈產(chǎn)氫后秸稈殘渣（AECH）的成分分析。由表5可以看出，利用稀酸高溫水解玉米秸稈時，秸稈的降解率為41.9%，半纖維素含量由30.9%急劇下降至1.5%，纖維素降解量較低。樣品中纖維素和半纖維素含量是以酸處理后秸稈固體殘渣為基準計算的，由于絕大多數(shù)半纖維素被降解，所以纖維素含量會相對增加。經(jīng)過纖維素酶水解處理后，秸稈的降解率進一步提高至67.8%，其中纖維素含量由59.6%降至38.6%。在玉米秸稈產(chǎn)氫過程中，秸稈中的纖維素進一步被混合產(chǎn)氫菌降解產(chǎn)氫，秸稈的降解率升至73.5%，纖維素含量由38.6%降至32.8%。這也證明了牛糞堆肥混合產(chǎn)氫菌具有直接降解纖維素產(chǎn)氫的能力。

3 小結(jié)

本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化玉米秸稈酶解條件，在酶解溫度51.8 ℃，pH 4.84、酶用量9.00 FPU/g TS的條件下，氫氣產(chǎn)量達到208.1 mL/g TVS。玉米秸稈經(jīng)稀酸水解和纖維素酶水解后纖維素和半纖維素被降解，天然產(chǎn)氫微生物主要利用其產(chǎn)生的可溶性糖發(fā)酵產(chǎn)氫。另外，天然產(chǎn)氫微生物也具有直接降解纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫的能力。

參考文獻：

[1] PAN C M，ZHANG M L，F(xiàn)AN Y T，et al.Production of cellulosic ethanol and hydrogen from solid-state enzymatic treated cornstalk：A two-stage process[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2009，57（7）：2732-2738.

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[3] NGUYEN T A D， HAN S J，KIM J P，et al. Hydrogen production by the hyperthermophilic eubacterium，Thermotoga neapolitana，using cellulose pretreated by ionic liquid[J]. International Journal of Hydrogen Energy，2008，33（19），5161-5168.

[4] LI D M， CHEN H Z. Biological hydrogen production from steam-exploded straw by simultaneous saccharification and fermentation[J]. International Journal of Hydrogen Energy，2007， 32（12）：1742-1748.

[5] ZHANG M L，F(xiàn)AN Y T，XING Y，et al. Enhanced biohydrogen production from cornstalk wastes with acidification pretreatment by mixed anaerobic cultures[J]. Biomass and Bioenergy， 2007， 31（4）：250-254.

[6] GOSWAMI D，SEN R，BASU J K，et al.Maximization of bioconversion of castor oil into ricinoleic acid by response surface methodology[J]. Bioresource Technology，2009，100（18）：4067-4073.

[7] GUO Y P， FAN S Q， FAN Y T， et al. The preparation and application of crude cellulase for cellulose-hydrogen production by anaerobic fermentation[J]. International Journal of Hydrogen Energy， 2010，35（2）： 459-468.

為檢驗?zāi)Ｐ偷臏蚀_性和有效性，在預(yù)測的最佳酶解條件下，對玉米秸稈進行5個平行的酶解處理試驗，然后利用玉米秸稈水解產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)氫氣。搖瓶培養(yǎng)試驗測得的氫氣產(chǎn)量為（208.1±5.8） mL/g TVS（n=5），試驗值與理論預(yù)測值非常接近，可見該模型能較好地預(yù)測酶解處理后玉米秸稈的氫氣發(fā)酵情況。

2.2 降解過程中玉米秸稈成分的變化

稀酸水解、酶水解等多種水解方式都可將玉米秸稈中的纖維素和半纖維素降解為小分子可溶性糖類。表5為原料秸稈（RC）、稀酸處理秸稈（AC）、稀酸-纖維素酶處理秸稈（AEC）和稀酸-纖維素酶處理秸稈產(chǎn)氫后秸稈殘渣（AECH）的成分分析。由表5可以看出，利用稀酸高溫水解玉米秸稈時，秸稈的降解率為41.9%，半纖維素含量由30.9%急劇下降至1.5%，纖維素降解量較低。樣品中纖維素和半纖維素含量是以酸處理后秸稈固體殘渣為基準計算的，由于絕大多數(shù)半纖維素被降解，所以纖維素含量會相對增加。經(jīng)過纖維素酶水解處理后，秸稈的降解率進一步提高至67.8%，其中纖維素含量由59.6%降至38.6%。在玉米秸稈產(chǎn)氫過程中，秸稈中的纖維素進一步被混合產(chǎn)氫菌降解產(chǎn)氫，秸稈的降解率升至73.5%，纖維素含量由38.6%降至32.8%。這也證明了牛糞堆肥混合產(chǎn)氫菌具有直接降解纖維素產(chǎn)氫的能力。

3 小結(jié)

本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化玉米秸稈酶解條件，在酶解溫度51.8 ℃，pH 4.84、酶用量9.00 FPU/g TS的條件下，氫氣產(chǎn)量達到208.1 mL/g TVS。玉米秸稈經(jīng)稀酸水解和纖維素酶水解后纖維素和半纖維素被降解，天然產(chǎn)氫微生物主要利用其產(chǎn)生的可溶性糖發(fā)酵產(chǎn)氫。另外，天然產(chǎn)氫微生物也具有直接降解纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫的能力。

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[7] GUO Y P， FAN S Q， FAN Y T， et al. The preparation and application of crude cellulase for cellulose-hydrogen production by anaerobic fermentation[J]. International Journal of Hydrogen Energy， 2010，35（2）： 459-468.

為檢驗?zāi)Ｐ偷臏蚀_性和有效性，在預(yù)測的最佳酶解條件下，對玉米秸稈進行5個平行的酶解處理試驗，然后利用玉米秸稈水解產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)氫氣。搖瓶培養(yǎng)試驗測得的氫氣產(chǎn)量為（208.1±5.8） mL/g TVS（n=5），試驗值與理論預(yù)測值非常接近，可見該模型能較好地預(yù)測酶解處理后玉米秸稈的氫氣發(fā)酵情況。

2.2 降解過程中玉米秸稈成分的變化

稀酸水解、酶水解等多種水解方式都可將玉米秸稈中的纖維素和半纖維素降解為小分子可溶性糖類。表5為原料秸稈（RC）、稀酸處理秸稈（AC）、稀酸-纖維素酶處理秸稈（AEC）和稀酸-纖維素酶處理秸稈產(chǎn)氫后秸稈殘渣（AECH）的成分分析。由表5可以看出，利用稀酸高溫水解玉米秸稈時，秸稈的降解率為41.9%，半纖維素含量由30.9%急劇下降至1.5%，纖維素降解量較低。樣品中纖維素和半纖維素含量是以酸處理后秸稈固體殘渣為基準計算的，由于絕大多數(shù)半纖維素被降解，所以纖維素含量會相對增加。經(jīng)過纖維素酶水解處理后，秸稈的降解率進一步提高至67.8%，其中纖維素含量由59.6%降至38.6%。在玉米秸稈產(chǎn)氫過程中，秸稈中的纖維素進一步被混合產(chǎn)氫菌降解產(chǎn)氫，秸稈的降解率升至73.5%，纖維素含量由38.6%降至32.8%。這也證明了牛糞堆肥混合產(chǎn)氫菌具有直接降解纖維素產(chǎn)氫的能力。

3 小結(jié)

本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化玉米秸稈酶解條件，在酶解溫度51.8 ℃，pH 4.84、酶用量9.00 FPU/g TS的條件下，氫氣產(chǎn)量達到208.1 mL/g TVS。玉米秸稈經(jīng)稀酸水解和纖維素酶水解后纖維素和半纖維素被降解，天然產(chǎn)氫微生物主要利用其產(chǎn)生的可溶性糖發(fā)酵產(chǎn)氫。另外，天然產(chǎn)氫微生物也具有直接降解纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫的能力。

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