王東升，張世棟（等）

摘要：采用紫外分光光度法測(cè)定催情助孕液中總黃酮的含量。以淫羊藿苷為對(duì)照品，甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果表明，淫羊藿苷在1.68～10.08 ？滋g/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，總黃酮平均回收率為99.29%，RSD為1.20%。催情助孕液中總黃酮含量為1.317 9%。采用紫外分光光度法測(cè)定催情助孕液中總黃酮的含量，操作快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于催情助孕液中總黃酮含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：催情助孕液；總黃酮；含量；紫外分光光度法

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.32；S853.73 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）07-1660-03

Determining the Content of Total Flavonoids in Cuiqingzhuyun Solution with Ultraviolet Spectrometry

WANG Dong-sheng， ZHANG Shi-dong， MIAO Xiao-lou， DONG Shu-wei，YAN Zuo-ting

（Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development， Ministry of Agriculture/Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS/ Engineering & Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province/Key Laboratory of New Animal Drug Project of Gansu Province， Lanzhou 730050， China）

Abstract： To determine the content of total flavonoids in Cuiqingzhuyun solution，icariin was used as standard solution and methanol was used as blank solution to measure the absorbance of the sample solution at 270 nm with UV spectophotometry. The results showed that the linear range for the content of icariin was 1.68～10.08 ？滋g/mL with the correlation coefficient of 0.999 5. The average recovery of total flavonoids was 99.29% and RSD was 1.20%. The content of total flavonids of Cuiqingzhuyun solution was 1.317 9%. It is indicated that method of determining of total flavonoids in Cuiqingzhuyun solution with UV spectrophotometry was rapid， accurate， convenient and practical.

Key words： Cuiqingzhuyun liquid； total flavonoids； content； UV spectrophotometry

催情助孕液是由淫羊藿、陽(yáng)起石、丹參等中藥制成的純中藥子宮灌注劑，臨床上主要用于治療奶牛卵巢靜止和持久黃體。據(jù)報(bào)道，催情助孕液治療奶牛卵巢靜止和持久黃體的總有效率達(dá)100%，治愈率達(dá)94%，治療奶牛持久黃體、卵巢靜止和卵巢囊腫后，平均發(fā)情率為99.4%，受孕率為81.5%[1，2]。有研究已對(duì)該制劑進(jìn)行了工藝優(yōu)化，并對(duì)淫羊藿苷含量測(cè)定等方面進(jìn)行了報(bào)道，但方法較為復(fù)雜[3-4]。淫羊藿苷為催情助孕液的主藥，總黃酮是淫羊藿苷的主要活性成分，對(duì)總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定可以更好地控制催情助孕液的質(zhì)量。為此，本試驗(yàn)建立了催情助孕液中總黃酮含量的測(cè)定方法，并對(duì)制劑中的總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-BlueStar Plus型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司）；AUW120D型分析天平（日本島津公司）；LD550型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Eppendorf移液器（德國(guó)Eppendorf公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。甲醇（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)：110737-200414，中國(guó)藥品生物制品檢定所）。催情助孕液（實(shí)驗(yàn)室配制）、去離子水。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取淫羊藿苷對(duì)照品0.42 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得16.8 ？滋g/mL淫羊藿苷對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取催情助孕液2 mL，置50 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，超聲處理15 min，精密吸取0.5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 ？滋m微孔濾膜濾過(guò)，即得。

1.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 吸取淫羊藿苷對(duì)照品溶液，以甲醇作空白對(duì)照，在190～400 nm內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度A對(duì)淫羊藿苷濃度C（μg/mL）進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算平均吸光度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取催情助孕液2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，每小時(shí)測(cè)一次，連續(xù)測(cè)定9次，記錄測(cè)定結(jié)果，計(jì)算平均吸光度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同批催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品的平均含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取5份總黃酮含量為1.319 0%的催情助孕液0.2 mL，各加入一定量的淫羊藿苷，置5 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，超聲處理15 min，精密吸取0.5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 ？滋m微孔濾膜濾過(guò)，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 樣品總黃酮含量測(cè)定 精密吸取不同批次的催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制備樣品供試液，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)

淫羊藿苷波長(zhǎng)掃描結(jié)果見(jiàn)圖1，淫羊藿苷在270 nm處有最大吸收峰，從而確定測(cè)定波長(zhǎng)為270 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以淫羊藿苷對(duì)照品溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為A = 0.036 5C -0.008 2，R2 = 0.999 5。說(shuō)明淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

5次測(cè)定的吸光度平均值為0.175 04，RSD為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

9次測(cè)定的吸光度平均值為0.184 74，RSD為1.09%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

5份樣品的平均含量為1.319 3%，RSD為0.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，平均回收率為99.29%，RSD為1.20%。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.7 樣品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

催情助孕液中平均總黃酮含量為1.317 9%。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 小結(jié)與討論

總黃酮是淫羊藿苷的主要有效成分，對(duì)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)精神系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等的疾病均有一定治療作用[5]，常將淫羊霍苷中總黃酮含量作為評(píng)價(jià)其質(zhì)量和提取分離工藝的指標(biāo)[6]?？傸S酮為淫羊藿苷的主要有效成分[7]，淫羊藿苷中總黃酮含量的測(cè)定方法多采用紫外分光光度法，以淫羊藿苷為指標(biāo)測(cè)定總黃酮含量的方法操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，為2010版《中國(guó)藥典》所載方法[8]。本試驗(yàn)將淫羊藿苷對(duì)照品的甲醇溶液在波長(zhǎng)190～400 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果在270 nm處檢測(cè)到有最大吸收峰。因此，選擇以淫羊藿苷為指標(biāo)性成分，在270 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行了催情助孕液中總黃酮的含量測(cè)定。結(jié)果表明，淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，試驗(yàn)建立的方法操作快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于催情助孕液中總黃酮含量的測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王東才.中藥催情助孕液治療奶牛卵巢性不孕癥[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2004（3）：34-35.

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[3] 關(guān)宇強(qiáng)，楊國(guó)林，梁紀(jì)蘭，等. HPLC法測(cè)定催情助孕液中淫羊藿苷含量的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)（科技版），2009（6）：102-103.

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[7] 黃秀蘭，周亞偉，王 偉. 淫羊藿黃酮類(lèi)化合物藥理研究進(jìn)展[J].中成藥，2005，27（6）：719-721.

[8] 王東升，張世棟，李世宏，等.淫羊藿總黃酮提取方法的比較研

究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)（科技版），2012（7）：75-77.

1.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算平均吸光度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取催情助孕液2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，每小時(shí)測(cè)一次，連續(xù)測(cè)定9次，記錄測(cè)定結(jié)果，計(jì)算平均吸光度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同批催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品的平均含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取5份總黃酮含量為1.319 0%的催情助孕液0.2 mL，各加入一定量的淫羊藿苷，置5 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，超聲處理15 min，精密吸取0.5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 ？滋m微孔濾膜濾過(guò)，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 樣品總黃酮含量測(cè)定 精密吸取不同批次的催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制備樣品供試液，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)

淫羊藿苷波長(zhǎng)掃描結(jié)果見(jiàn)圖1，淫羊藿苷在270 nm處有最大吸收峰，從而確定測(cè)定波長(zhǎng)為270 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以淫羊藿苷對(duì)照品溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為A = 0.036 5C -0.008 2，R2 = 0.999 5。說(shuō)明淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

5次測(cè)定的吸光度平均值為0.175 04，RSD為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

9次測(cè)定的吸光度平均值為0.184 74，RSD為1.09%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

5份樣品的平均含量為1.319 3%，RSD為0.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，平均回收率為99.29%，RSD為1.20%。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.7 樣品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

催情助孕液中平均總黃酮含量為1.317 9%。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 小結(jié)與討論

總黃酮是淫羊藿苷的主要有效成分，對(duì)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)精神系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等的疾病均有一定治療作用[5]，常將淫羊霍苷中總黃酮含量作為評(píng)價(jià)其質(zhì)量和提取分離工藝的指標(biāo)[6]。總黃酮為淫羊藿苷的主要有效成分[7]，淫羊藿苷中總黃酮含量的測(cè)定方法多采用紫外分光光度法，以淫羊藿苷為指標(biāo)測(cè)定總黃酮含量的方法操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，為2010版《中國(guó)藥典》所載方法[8]。本試驗(yàn)將淫羊藿苷對(duì)照品的甲醇溶液在波長(zhǎng)190～400 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果在270 nm處檢測(cè)到有最大吸收峰。因此，選擇以淫羊藿苷為指標(biāo)性成分，在270 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行了催情助孕液中總黃酮的含量測(cè)定。結(jié)果表明，淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，試驗(yàn)建立的方法操作快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于催情助孕液中總黃酮含量的測(cè)定。

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[3] 關(guān)宇強(qiáng)，楊國(guó)林，梁紀(jì)蘭，等. HPLC法測(cè)定催情助孕液中淫羊藿苷含量的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)（科技版），2009（6）：102-103.

[4] 王東升，張世棟，李世宏，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)化催情助孕液制備工藝[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（29）：75-78.

[5] 陸 樂(lè)，徐 洋，蔡 輝.淫羊藿總黃酮研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，37（2）：167-170.

[6] 陳肖家，張慶文，季 暉，等.紫外分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定淫羊藿總黃酮含量的比較研究[J].藥物分析雜志，2007， 27（5）：625-630.

[7] 黃秀蘭，周亞偉，王 偉. 淫羊藿黃酮類(lèi)化合物藥理研究進(jìn)展[J].中成藥，2005，27（6）：719-721.

[8] 王東升，張世棟，李世宏，等.淫羊藿總黃酮提取方法的比較研

究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)（科技版），2012（7）：75-77.

1.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液3 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算平均吸光度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取催情助孕液2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，每小時(shí)測(cè)一次，連續(xù)測(cè)定9次，記錄測(cè)定結(jié)果，計(jì)算平均吸光度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同批催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品的平均含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取5份總黃酮含量為1.319 0%的催情助孕液0.2 mL，各加入一定量的淫羊藿苷，置5 mL容量瓶中，加60%乙醇至刻度，超聲處理15 min，精密吸取0.5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 ？滋m微孔濾膜濾過(guò)，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.9 樣品總黃酮含量測(cè)定 精密吸取不同批次的催情助孕液5份，每份2 mL，按“1.2.2”方法制備樣品供試液，以甲醇作空白對(duì)照，在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)

淫羊藿苷波長(zhǎng)掃描結(jié)果見(jiàn)圖1，淫羊藿苷在270 nm處有最大吸收峰，從而確定測(cè)定波長(zhǎng)為270 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以淫羊藿苷對(duì)照品溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程為A = 0.036 5C -0.008 2，R2 = 0.999 5。說(shuō)明淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

5次測(cè)定的吸光度平均值為0.175 04，RSD為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

9次測(cè)定的吸光度平均值為0.184 74，RSD為1.09%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

5份樣品的平均含量為1.319 3%，RSD為0.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，平均回收率為99.29%，RSD為1.20%。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.7 樣品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

催情助孕液中平均總黃酮含量為1.317 9%。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 小結(jié)與討論

總黃酮是淫羊藿苷的主要有效成分，對(duì)免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)精神系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等的疾病均有一定治療作用[5]，常將淫羊霍苷中總黃酮含量作為評(píng)價(jià)其質(zhì)量和提取分離工藝的指標(biāo)[6]。總黃酮為淫羊藿苷的主要有效成分[7]，淫羊藿苷中總黃酮含量的測(cè)定方法多采用紫外分光光度法，以淫羊藿苷為指標(biāo)測(cè)定總黃酮含量的方法操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，為2010版《中國(guó)藥典》所載方法[8]。本試驗(yàn)將淫羊藿苷對(duì)照品的甲醇溶液在波長(zhǎng)190～400 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果在270 nm處檢測(cè)到有最大吸收峰。因此，選擇以淫羊藿苷為指標(biāo)性成分，在270 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行了催情助孕液中總黃酮的含量測(cè)定。結(jié)果表明，淫羊藿苷在1.68～10.08 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，試驗(yàn)建立的方法操作快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，適用于催情助孕液中總黃酮含量的測(cè)定。

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