周海燕，高 晨，張景科，周麗雅，王小梅，田蔓男，魏志誠

(1. 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院眼科；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院病理科，甘肅蘭州 730000；3. 蘭州軍區(qū)總醫(yī)院 安寧分院創(chuàng)傷外科，甘肅蘭州 730070；4. 蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，甘肅蘭州 730000； 5. 甘肅省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科電生理檢查室，甘肅蘭州 730000)

外傷性視神經(jīng)損傷是指外力沖擊作用下所導(dǎo)致的視功能部分或全部喪失，可以是永久性的亦可以是暫時(shí)性的，是重要的外傷性致盲因素之一[1-2]。由于缺乏理想的治療方法，常給患者帶來不可逆轉(zhuǎn)的視功能喪失。視神經(jīng)挫傷后視網(wǎng)膜病變的機(jī)理十分復(fù)雜，涉及多因素的病變，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)微環(huán)境的改變所產(chǎn)生的大量自由基可引起對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的繼發(fā)性損傷作用[3]。本實(shí)驗(yàn)以活體動(dòng)物為基礎(chǔ)，通過建立視神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型，觀察活性氧的表達(dá)與視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的關(guān)系，并研究新型自由基清除劑依達(dá)拉奉對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用,以探討視神經(jīng)挫傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷機(jī)制及藥物治療。

1 材料與方法

1.1材料與分組選擇192只(384眼)健康清潔級(jí)SD大鼠(購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)，體質(zhì)量230～250 g，雌雄兼用，健康無眼疾。隨機(jī)等分為正常組、假手術(shù)組、對(duì)照組、治療組，每組各48只，16只用于活性氧的檢測(cè)，16只用于細(xì)胞凋亡率檢測(cè)，8只用于透射電鏡觀察，剩余8只隨組飼養(yǎng)，備用。每只鼠雙眼用于實(shí)驗(yàn)。TUNEL檢測(cè)試劑盒購自羅氏(Roche)公司，2′，7′-二氯雙氫熒光素雙乙酸酯(2′，7′-dichlorofluorescin-diacetate, DCFH-DA)購自美國Sigma公司，Annexin Ⅴ異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC)試劑盒購自Pharmingen公司，依達(dá)拉奉注射液(edaravone, MCI-186)購自南京先聲東元制藥有限公司。檢測(cè)儀器:熒光顯微鏡(OLYMPUS-AX80日本)；流式細(xì)胞儀(美國BECKMAN-COULTER Epics XL-4型)；激光共聚焦顯微鏡(德國LEICA TCS SP2)；透射電鏡(日本電子公司JEM-1230)。

1.2視神經(jīng)鉗夾傷建模方法對(duì)照組和治療組采用1 g/L戊巴比妥鈉(20 mg/kg)腹膜注射麻醉大鼠后，按NAKAZAWA等[4]的方法暴露視神經(jīng)。剪開外眥角，沿角膜緣右眼6∶00～12∶00，左眼12∶00～6∶00，呈180度切開球結(jié)膜并向后鈍性分離暴露視神經(jīng)，并于球后1.0 mm處用微血管止血鉗(頭部寬1 mm，長18 mm)夾持7 s(上緊2齒)，用直接檢眼鏡觀察眼底，眼底無缺血者為造模成功。縫合球結(jié)膜和外眥角，涂眼膏。術(shù)中盡可能鈍性分離并避開血管以不影響眼球的血液供應(yīng)，同時(shí)盡可能減少對(duì)視神經(jīng)的牽拉。術(shù)后2 d出現(xiàn)Marcus-gun瞳孔，眼球無突出, 眼底無出血者納入。正常組不做處理，假手術(shù)組按造模方法暴露視神經(jīng)，但不鉗夾。

1.3給藥方法治療組在造模后立即腹腔注射依達(dá)拉奉30 mg/kg，每隔12 h腹腔注射給藥。給藥時(shí)間為每次30 min，共14 d，每天2次。正常組、對(duì)照組、假手術(shù)組正常飲食，不給予任何治療。

1.4活性氧的測(cè)定于實(shí)驗(yàn)后3、6、10、14 d各組分別取4只大鼠，麻醉后立即摘除雙眼球，在顯微鏡下剝離全層視網(wǎng)膜組織，200目沙網(wǎng)研磨、沖洗過濾, 收取單細(xì)胞懸液，DCFH-DA用PBS溶解(終濃度為20 μmol/L)每個(gè)樣品收集10×103個(gè)細(xì)胞，37 ℃避光負(fù)載30 min，依次上機(jī)檢測(cè)每組活性氧含量。

1.5細(xì)胞凋亡率檢測(cè)于實(shí)驗(yàn)后3、6、10、14 d各組分別取4只大鼠，同上法制作單細(xì)胞懸液，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞濃度為1×109L-1，依照Annexin Ⅴ/PI試劑盒操作說明進(jìn)行處理后立即上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。同時(shí)滴片用激光共聚焦顯微鏡觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡形態(tài)。

1.6透射電鏡標(biāo)本的制作于實(shí)驗(yàn)后3、6、10、14 d各組分別取2只大鼠，眼球摘除后迅速浸入25 g/L戊二醛溶液中固定24 h，沿赤道部剪開,棄去眼前節(jié)，取后極部視網(wǎng)膜切成1 mm×6 mm左右的組織塊共6～8塊，再按常規(guī)的方法制作電子顯微鏡樣品，觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)并照相。

2 結(jié) 果

2.1各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ROS水平的比較方差分析及兩兩比較結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜細(xì)胞中活性氧的表達(dá)量在3、6、10、14 d時(shí)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組較治療組和正常組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，假手術(shù)與正常組間相比無顯著性差異(表1)。

表1各組間細(xì)胞內(nèi)ROS水平的比較

Tab.1 Comparison of ROS levels in the retinal cells between the experimental groups

組 別眼球數(shù)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(%)3d6d10d14d正常組832.53±2.20343.60±3.63532.80±1.95245.33±2.902假手術(shù)組833.48±1.42444.48±2.62234.09±2.82140.03±0.804對(duì)照組892.83±2.87599.90±0.10099.30±1.21292.47±2.159治療組884.57±3.75465.13±5.30863.40±5.22666.99±6.320

2.2各實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率的比較每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組較治療組和正常組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，假手術(shù)與正常組間相比無顯著性差異(表2)。

表2各組間視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率的比較

Tab.2 Comparison of apoptosis rate of the retinal cells between the experimental groups

組 別眼球數(shù)視網(wǎng)膜細(xì)胞總凋亡率(%)3d6d10d14d正常組89.55±0.32510.38±0.64211.54±1.22410.52±0.839假手術(shù)組810.44±1.0029.50±0.65210.22±1.77411.05±0.526對(duì)照組835.51±3.08637.55±2.35740.22±5.01134.32±3.351治療組822.96±2.57427.59±1.36933.95±4.58025.81±2.170

2.3激光共聚焦檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞形態(tài)的變化激光共聚焦顯微鏡觀察, 正常組及假手術(shù)組僅見極少數(shù)凋亡細(xì)胞；對(duì)照組第3天，見大量凋亡早期細(xì)胞，呈Annexin V高染而PI低染，細(xì)胞膜呈綠色而細(xì)胞核不著色；對(duì)照組第6、10天，見大量凋亡早、中、晚期細(xì)胞。Annexin V和PI均為高染，細(xì)胞膜呈綠色而細(xì)胞核呈紅色;部分細(xì)胞的核呈碎片狀或梅花狀,為典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)。治療組各期凋亡細(xì)胞均少于對(duì)照組(圖1)。

圖1各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡形態(tài)的觀察

Fig.1 Morphology of cell apoptosis observed under laser confocal microscope in the experimental groups

A：正常組14 d；B：假手術(shù)組造模后14 d；C：治療組造模后14 d；D：對(duì)照組造模后14 d。

2.4透射電鏡觀察各實(shí)驗(yàn)組RGCs細(xì)胞凋亡超微結(jié)構(gòu)的改變透射電鏡檢查顯示：正常組與假手術(shù)組大鼠RGCs呈橢圓形，核大、呈卵圓形，核質(zhì)均勻，常染色質(zhì)較多，異染色質(zhì)較少。細(xì)胞質(zhì)占細(xì)胞比例小，細(xì)胞器豐富，可見高爾基體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯脫顆粒現(xiàn)象，線粒體板狀嵴規(guī)則，游離核糖體豐富；對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜及視神經(jīng)較正常組出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)變化。損傷3～14 d可見RGCs外形不規(guī)則，核膜內(nèi)陷，異染色質(zhì)增多，聚集成團(tuán)塊狀，沿核膜分布，線粒體腫脹，嵴斷裂、融合或消失，部分線粒體基質(zhì)水腫，出現(xiàn)“空化”現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒，高爾基體、游離核糖體減少。治療組損傷較對(duì)照組有明顯減輕(圖2)。

圖2各實(shí)驗(yàn)組RGCs超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察

Fig.2 The ultrastructural changes of RGCs detected by TEM in the experimental groups

A：正常組(×8 000)；B：假手術(shù)組(×8 000)。以上2組可見RGCs呈橢圓形、核大，呈卵圓形，核質(zhì)均勻，常染色質(zhì)較多，異染色質(zhì)較少。C：對(duì)照組造模后3 d，核膜內(nèi)陷，異染色質(zhì)增多，聚集成團(tuán)塊狀，沿核膜分布，線粒體腫脹，嵴斷裂、融合或消失，部分線粒體基質(zhì)水腫，部分呈“空化”現(xiàn)象(×10 000)。D：治療組造模后3 d，損傷較對(duì)照組明顯減輕(×8 000)。

3 討 論

外傷性視神經(jīng)病變是外力對(duì)視神經(jīng)的沖擊或擠壓損傷，是常見的眼外傷類型。成年哺乳動(dòng)物視神經(jīng)屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分。視神經(jīng)損傷后,血管營養(yǎng)障礙，造成局部組織缺血、缺氧、水腫，反過來又加重局部缺血和軸索損傷, 多數(shù)患者常引起不可逆的視力喪失。因此, 根據(jù)外傷性視神經(jīng)病變的發(fā)生機(jī)制,視神經(jīng)受損的嚴(yán)重程度和救治是否及時(shí)決定著傷眼的視力預(yù)后[5]。

對(duì)外傷性視神經(jīng)損傷的發(fā)病機(jī)制、神經(jīng)修復(fù)再生規(guī)律以及其治療效果的研究依賴于穩(wěn)定可靠的視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型。鉗夾視神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型是目前應(yīng)用廣泛的視神經(jīng)損傷模型,是用不同的致傷器將視神經(jīng)自視交叉前任一部位夾傷[6-7]，保持了視神經(jīng)外膜的完整，并可以部分定量，這種模型的致傷率高，接近臨床損傷特征，不僅是公認(rèn)的較精確的視神經(jīng)不全損傷的模型，還用于青光眼視神經(jīng)損傷和中樞神經(jīng)損傷的研究模型[8]。

視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)的代表，它的再生和保護(hù)機(jī)制近年來得到深入而廣泛的研究，視神經(jīng)損傷后對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的保護(hù)主要是停止或防止其發(fā)生凋亡。目前的研究表明，視神經(jīng)損傷后造成RGCs的凋亡，是導(dǎo)致視力不可逆轉(zhuǎn)階段的原因，阻止RGCs的凋亡有助于急性視神經(jīng)病變的治療。視神經(jīng)損傷后RGCs的凋亡可能涉及的機(jī)制包括：①視神經(jīng)損傷導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生增多，富含不飽和脂肪酸的RGCs軸索及細(xì)胞膜受到自由基的攻擊而發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時(shí)自由基可介導(dǎo)Ca2+超載及蛋白質(zhì)損傷等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；②由于神經(jīng)損傷后產(chǎn)生軸漿運(yùn)輸障礙，導(dǎo)致由上丘或外側(cè)膝狀體運(yùn)輸至視網(wǎng)膜RGCs的神經(jīng)營養(yǎng)因子等物質(zhì)缺乏或減少；③興奮性氨基酸的毒性作用:視神經(jīng)損傷導(dǎo)致了細(xì)胞外液谷氨酸、天門冬氨酸等興奮性氨基酸明顯升高，促進(jìn)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，Ca2+的增加作為第二信使，激活其他誘發(fā)凋亡的物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9-12]。④一氧化氮(nitric oxide, NO)的毒性作用：NO作為神經(jīng)毒素因子，參與神經(jīng)系統(tǒng)的多種病理損傷過程，可介導(dǎo)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡；⑤半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的毒性作用：Caspase是RGCs繼發(fā)性死亡的主要介質(zhì)，Caspases的抑制劑可以通過直接的抑制凋亡和減少來自免疫系統(tǒng)的繼發(fā)性損害而減輕缺血對(duì)神經(jīng)元的損害[13]。

細(xì)胞凋亡是有核細(xì)胞在一定條件下通過啟動(dòng)其內(nèi)部自身機(jī)制，主要是通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞死亡過程[14-15]。在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至細(xì)胞膜外側(cè)[15]，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸Annexin V/PI熒光標(biāo)記雙染色流式細(xì)胞技術(shù)是目前量化檢測(cè)凋亡細(xì)胞的可靠方法。本實(shí)驗(yàn)使用Annexin Ⅴ/PI熒光標(biāo)記雙染色法可靈敏區(qū)分正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法[16-17]。凋亡細(xì)胞的特征性形態(tài)改變是核染色質(zhì)凝集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠RGCs的細(xì)胞核發(fā)生了核固縮、染色質(zhì)邊集與核膜內(nèi)陷等改變，而這些改變均為典型的凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征[18]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷后,可生成自由基、活性氧并引發(fā)脂類、糖類等一些氧化毒性產(chǎn)物致細(xì)胞毒作用而損傷細(xì)胞。ROS即氧自由基及其衍生物，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。ROS參與細(xì)胞凋亡的機(jī)制可發(fā)生在凋亡過程的各個(gè)環(huán)節(jié)[19]。DCFH-DA具有親脂性，很容易通過細(xì)胞膜，在胞內(nèi)被脂酶分解，去酰基形成有極性的DCFH，但DCFH不產(chǎn)生熒光，而ROS能夠氧化DCFH為DCF，在流式細(xì)胞儀525nm處檢測(cè)到綠色熒光，其DCF形成量與細(xì)胞氧化產(chǎn)物水平呈正比。因此，其熒光強(qiáng)度間接代表細(xì)胞內(nèi)過氧化物的水平[20]

早期進(jìn)行積極的藥物治療,對(duì)修復(fù)受損的視神經(jīng)具有重要的價(jià)值。依達(dá)拉奉是一種新型自由基清除劑，化學(xué)名為3-甲基-1-苯基-2·吡唑啉-5-酮，商品名為Radicut。目前，臨床主要用于腦缺血和腦梗塞后的治療，對(duì)腦缺血具有強(qiáng)大的保護(hù)作用，是一種有效的中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)劑。其作用機(jī)制主要與消除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉可以減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)機(jī)能障礙，保護(hù)神經(jīng)的缺血缺氧損傷，減輕其他組織缺血缺氧再灌注損傷[21-22]。對(duì)實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜脫離視神經(jīng)細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用[23]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠視神經(jīng)鉗夾傷后3 d對(duì)照組檢測(cè)到視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，10 d時(shí)達(dá)高峰，14 d時(shí)有所下降，結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡發(fā)生于視網(wǎng)膜各層，主要集中在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。其機(jī)制可能為視神經(jīng)夾挫傷對(duì)軸突產(chǎn)生直接的機(jī)械壓迫效應(yīng)造成部分軸突損傷，受損的節(jié)細(xì)胞在釋放的細(xì)胞毒素、氧自由基、鈣離子超載或CO毒性等一系列毒理因子作用下，發(fā)生以凋亡為主的繼發(fā)性改變，使節(jié)細(xì)胞進(jìn)行性丟失，最終導(dǎo)致視功能喪失[24]。本實(shí)驗(yàn)通過用DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞定量檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)ROS水平，用AnnexinV/PI雙染色法定量檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率，透射電鏡觀察RGCs超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)鉗夾大鼠視神經(jīng)能引起視網(wǎng)膜細(xì)胞產(chǎn)生ROS，誘發(fā)RGCs的凋亡，依達(dá)拉奉通過清除ROS，減輕了細(xì)胞損傷，降低了細(xì)胞凋亡率，有效的保護(hù)了RGCs，是很有臨床應(yīng)用前景的新型視神經(jīng)保護(hù)劑。

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