賀曉玉

運動訓練對脊髓損傷大鼠脊髓內(nèi)BDNF及其受體TrkB表達的影響*

賀曉玉△

目的 研究運動訓練對脊髓損傷（SCI）大鼠脊髓內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）及其酪氨酸激酶受體B（TrkB）表達的影響。方法24只SD大鼠隨機均分為假手術組、損傷對照組和運動訓練組。采用通用型脊髓打擊器建立T10 SCI大鼠模型。運動訓練組于損傷后1周起對大鼠進行4周運動訓練，假手術組和損傷對照組不進行運動訓練。采用BBB評分觀察損傷前及損傷后第1～5周大鼠后肢運動功能的變化。運動訓練結束后取大鼠T12～L1節(jié)段脊髓，免疫組化結合圖像平均光密度分析觀察脊髓組織BDNF和TrkB的表達及分布，Western blot檢測脊髓內(nèi)BDNF和TrkB蛋白含量。結果損傷前，3組大鼠BBB評分為21.00分。損傷后，損傷對照組及運動訓練組BBB評分均低于假手術組（均P＜0.05）。損傷3周后運動訓練組BBB評分高于損傷對照組（P＜0.05）。BDNF、TrkB免疫反應陽性產(chǎn)物均多分布于脊髓前角、脊髓后角及中央管周圍；運動訓練組BDNF、TrkB陽性染色顆粒均增多，平均光密度值均高于假手術組和損傷對照組（均P＜0.05）。運動訓練組大鼠脊髓內(nèi)BDNF及TrkB的表達高于假手術組和損傷對照組。結論運動訓練能誘導SCI大鼠脊髓內(nèi)BDNF及其受體TrkB表達，促進其運動功能恢復。

脊髓損傷；運動療法；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；受體，trkB；免疫組織化學；印跡法，蛋白質(zhì)；運動訓練

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種主要由外傷引起的目前幾乎不可治愈的致殘性傷害，SCI患者常伴有嚴重的運動和感覺功能障礙。運動訓練作為康復治療的一種重要手段，廣泛用于現(xiàn)階段脊髓損傷的康復治療，其臨床療效為大量研究所認可[1]。但運動訓練促進脊髓損傷修復的作用機制仍不十分清楚。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)是一種保護性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，對多種神經(jīng)元的發(fā)育分化和生長再生具有維持和促進作用，能挽救損傷脊髓運動和感覺神經(jīng)元[2]。本研究在建立SCI大鼠模型基礎上，觀察運動訓練對SCI大鼠損傷脊髓內(nèi)BDNF及其酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)蛋白表達的影響，探討運動訓練促進脊髓損傷修復的作用機制，為脊髓損傷的康復治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級成年雌性SD大鼠24只，體質(zhì)量（227±25）g，購自南方醫(yī)科大學動物中心。采用完全隨機法將其分為假手術組、損傷對照組(損傷后不訓練)和運動訓練組(術后1周開始訓練，共4周)，每組8只。

1.2 實驗儀器及試劑 通用型脊髓打擊器(SS-Ⅱ型)由中山大學脊髓損傷研究所提供。滾筒式網(wǎng)狀訓練器及跑步訓練器購自杭州段氏制造。兔抗鼠BDNF一抗購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗鼠TrkB一抗、加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自CST公司；PV-9000二步法免疫組化檢測試劑盒購自美國GBI公司，DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SCI模型制作 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，切除T10椎板，暴露脊髓。通用型脊髓打擊器10 g重錘自4 cm高度處自由下落，制成T10段SCI模型[3]。圍手術期肌內(nèi)注射青霉素20萬IU/kg預防感染，連續(xù)3 d；并定時進行膀胱按摩，協(xié)助排便。

1.3.2 運動訓練 運動訓練于脊髓損傷后1周開始，包括滾筒式網(wǎng)狀訓練和減重平板訓練。滾筒訓練：將大鼠置于轉速為5 r/min的網(wǎng)狀滾筒訓練器中，大鼠在滾筒訓練器內(nèi)進行抓握、攀爬等運動訓練。減重平板訓練采用跑步機及減重裝置。跑臺速度為0.8 km/h。減質(zhì)量為體質(zhì)量的20%～40%(隨時間延長逐漸降低減質(zhì)量程度，第1周減質(zhì)量40%，第2周35%，第3周30%，第4周20%)。每天運動訓練2次，每次10 min，每周連續(xù)訓練5 d，共訓練4周。假手術組和損傷對照組置于籠內(nèi)不進行運動訓練。

1.3.3 Basso、Beattie、Bresnahan(BBB)運動功能評分 將大鼠放入一固定場所，觀察大鼠后肢運動、軀干位置及穩(wěn)定性、步態(tài)協(xié)調(diào)性、爪的位置、足趾間隙及尾的位置等變化，采用BBB行為功能評定量表評定大鼠后肢運動功能。完全截癱為0分，正常為21分。于損傷前及損傷后1、2、3、4、5周，由兩名熟悉BBB評分標準的非本研究人員同時進行盲法評分，取平均值。

1.3.4 免疫組化檢測 運動訓練結束后，10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，4%多聚甲醛心臟灌注固定，取大鼠T12～L1節(jié)段脊髓，經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片。免疫組化結合圖像平均光密度分析觀察脊髓組織BDNF和TrkB的表達及分布情況。按試劑盒說明進行免疫組化二步法染色，應用圖像分析系統(tǒng)測定BDNF和TrkB免疫組化染色平均光密度值。

1.3.5 Western blot檢測 取脊髓組織充分研磨，抽提蛋白，取蛋白上樣液，經(jīng)10%SDS凝膠電泳分離，轉移蛋白至PVDF印跡膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉非特異性免疫反應結合位點，用BDNF、TrkB一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。在ECL發(fā)光反應系統(tǒng)中反應5 min，暗室壓片1 min，膠片顯影。以兔抗GAPDH抗體和山羊抗兔IgG抗體為一抗和二抗，重復上述步驟作為內(nèi)參照。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用IBM SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組BBB評分比較 脊髓損傷前，3組大鼠BBB評分為21.00分。脊髓損傷后，損傷對照組及運動訓練組BBB評分均低于假手術組（均P＜0.05）。損傷后1～2周，運動訓練組BBB評分與損傷對照組差異無統(tǒng)計學意義；損傷3周后運動訓練組BBB評分高于損傷對照組（P＜0.05），見表1。

Table 1 BBB scores of rats in each groups at different time points表1 各組大鼠不同時間點BBB評分 （n=8±s）

Table 1 BBB scores of rats in each groups at different time points表1 各組大鼠不同時間點BBB評分 （n=8±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與損傷對照組比較，P＜0.05

組別假手術組損傷對照組運動訓練組F損傷前21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 -損傷后1周21.00±0.00 3.43±1.19a3.45±1.37a494.000＊＊損傷后2周21.00±0.00 9.13±1.36a11.51±1.64a131.045＊＊組別假手術組損傷對照組運動訓練組F損傷后3周21.00±0.00 10.42±1.68a14.13±1.75ab70.459＊＊損傷后4周21.00±0.00 11.72±1.79a16.01±1.98ab48.862＊＊損傷后5周21.00±0.00 13.24±1.86a17.32±2.13ab30.480＊＊

2.2 BDNF免疫組化檢測結果 BDNF免疫反應陽性產(chǎn)物多分布于脊髓前角的神經(jīng)元內(nèi)，脊髓后角及中央管周圍也有出現(xiàn)。運動訓練組BDNF陽性染色顆粒明顯增多，見圖1。運動訓練組平均光密度值高于假手術組和損傷對照組（P＜0.05），見圖2。

Figure 1 Expression of BDNF in spinal cord tissues of rats detected by immunohistochemistry(immunohistochemical staining,×200)圖1 各組大鼠脊髓內(nèi)BDNF蛋白的表達(免疫組化染色，×200)

Figure 2 Integrated optical density of BDNF protein expression in spinal cord tissues of rats in each groups圖2 各組大鼠脊髓內(nèi)BDNF蛋白平均光密度值

2.3 TrkB免疫組化檢測結果 TrkB免疫反應陽性產(chǎn)物較多分布于脊髓前角、后角、中央管周圍等處。運動訓練組TrkB陽性染色顆粒增多，見圖3。運動訓練組平均光密度值高于假手術組和損傷對照組（P＜0.05），見圖4。

Figure 3 Expression of TrkB protein in spinal cord tissues of rats detected by immunohistochemistry(immunohistochemical staining,×200)圖3 各組大鼠脊髓內(nèi)TrkB蛋白的表達(免疫組化染色，×200)

Figure 4 Integrated optical density of TrkB protein expression in spinal cord tissues of rats in each groups圖4 各組大鼠脊髓內(nèi)TrkB蛋白平均光密度值

2.4 Western blot檢測結果 運動訓練組大鼠脊髓內(nèi)BDNF和TrkB蛋白表達較損傷對照組、假手術組增高，見圖5。

Figure 5 Expression of BDNF and TrkB proteins in spinal cord tissues of rats detected by Western blot圖5 Western blot檢測SCI大鼠脊髓組織中BDNF和TrkB蛋白表達

3 討論

研究表明，運動訓練可以促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能結構重組及可塑性改變[4-5]，并改善SCI患者肢體運動和感覺功能障礙的恢復[1]。但其神經(jīng)生物學基礎并不十分清楚。本研究于SCI大鼠損傷后1周開始進行4周運動訓練，采用BBB評分觀察運動訓練后SCI大鼠后肢運動功能的變化。結果顯示，損傷后第1～2周，運動訓練組與損傷對照組BBB評分無明顯差異，與其他學者研究結果一致[6]。而損傷后第3～5周，運動訓練組BBB評分高于損傷對照組，提示運動訓練可促進SCI大鼠后肢運動功能的恢復。

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、維持和損傷修復具有重要影響[2,5]。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF能夠提高受損脊髓運動和感覺神經(jīng)元的存活，促進神經(jīng)元的再生與修復[7]。BDNF基因修飾的神經(jīng)干細胞移植可促進大鼠脊髓損傷后軸突再生及后肢運動功能的恢復，優(yōu)于未修飾的神經(jīng)干細胞移植，提示BDNF可促進SCI神經(jīng)軸突的結構重建從而促進后肢運動功能恢復[8]。目前研究認為，BDNF通過與其受體TrkB結合，激活MAPK、PI3K等信號通路活化CREB，發(fā)揮促進神經(jīng)元存活以及增強突觸可塑性的作用[9-10]。鑒于BDNF及其受體TrkB對神經(jīng)元生理功能的維持及損傷后修復的積極作用，筆者研究了BDNF及其受體TrkB在運動訓練促進脊髓損傷修復中的可能作用，結果顯示4周運動訓練后SCI大鼠脊髓內(nèi)BDNF及TrkB表達均上升，提示BDNF及其受體TrkB可能參與了損傷脊髓的修復。結合BBB評分結果，運動訓練組BBB評分高于與同一時間點上的損傷對照組，表明規(guī)律的運動訓練后SCI大鼠后肢運動功能的改善，可能與脊髓內(nèi)BDNF及TrkB表達上調(diào)有關。

綜上所述，運動訓練可誘導SCI大鼠脊髓內(nèi)BDNF及其受體TrkB表達，促進SCI大鼠運動功能恢復，為康復訓練治療脊髓損傷后神經(jīng)重建修復提供了新的實驗依據(jù)。然而運動訓練促進BDNF表達增加的分子機制尚不十分清楚，有待深入研究。

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（2013-11-01收稿 2014-02-21修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effects of Exercise on Expressions of Brain-Derived Neurotrophic Factor and Tyrosine Kinase Receptor B in Injured Spinal Cord of Rats

HE Xiaoyu
Guangdong Provincial Institute of Sports Science,Guangzhou 510663,China

ObjectiveTo investigate the effects of exercise on expressions of brain-derived neurotrophic factor (BDNF)and tyrosine kinase receptor B(TrkB)in spinal cord of spinal cord injury(SCI)rats.MethodsSpinal cord injury models were produced by universal spinal cord impact system.Twenty-four Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups,exercise group(SCI-induction and exercises,n=8),control group(SCI-induction without exercises,n=8)and shamoperation group(no operation,without SCI nor exercises,n=8).Exercise training began from the 7th day after injury for 4 weeks.The locomotor function was assessed by Basso-Beattic-Bresnahan(BBB)scale before injury and at the 1st,2nd,3rd, 4th and 5th week post injury.The expressions level of BDNF and TrkB in spinal cords were detected by immunohistochemistry and Western blot.ResultsSince the 3rd week after injury(after 2 weeks of exercise training),BBB scores in exercise group were higher than that in control group(P＜0.05).In immunohistochemistry test,positive immunologic reaction to BDNF protein was mainly located in anterior horn of spinal cord,and the expression level in exercise group was significantly higher than that in sham-operation group and control group(P＜0.05).In immunohistochemistry test,positive immunologic reaction to TrkB protein was located in anterior horn and dorsal horn and central canal of spinal cord,and the expression level in exercise group was significantly higher than that in sham-operation group and control group(P＜0.05).Expression of BDNF and TrkB in exercise group rats after exercise for 4 weeks were significantly increased,compared with that in control group.ConclusionExercise training may effectively induce BDNF and TrkB expression in spinal cords and promote the recovery of locomotor function of SCI rats.

spinal cord injuries;exercise therapy;brain-derived neurotrophic factor;receptor,trkB;immunohistochemistry;blotting,Western;exercise training

R651.21

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.010

*廣東省科技計劃項目科技基礎條件建設項目（項目編號：2010B060500021）

廣東省體育科學研究所（郵編510663）

△通訊作者 E-mail：gzhxy2010@126.com