許 敏 李 紅

強(qiáng)力霉素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及Notch1、MMP-9表達(dá)的影響*

許 敏 李 紅△

目的 研究強(qiáng)力霉素對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞的增殖及Notch1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表達(dá)的影響，為胃癌的治療提供新的抗腫瘤藥物。方法分別以0、5、10、20、40 mg/L終濃度的強(qiáng)力霉素作用于人胃癌細(xì)胞系BGC-823，運(yùn)用MTT法檢測細(xì)胞增殖程度；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布的影響；Western Blot檢測Notch1、MMP-9蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果強(qiáng)力霉素能夠抑制人胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞的增殖，且有劑量及時(shí)間依賴性（P＜0.01）；強(qiáng)力霉素能夠改變胃癌細(xì)胞BGC-823周期的分布，隨著濃度的增加，S期所占比例降低；并且隨著濃度的增加，Notch1的表達(dá)增強(qiáng)，MMP-9的表達(dá)降低（P＜0.01）。結(jié)論強(qiáng)力霉素能夠抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖，促進(jìn)Notch1上調(diào)為可能的機(jī)制之一。

胃腫瘤；細(xì)胞系,腫瘤；受體,Notch1；基質(zhì)金屬蛋白酶9；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；強(qiáng)力霉素

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均較高，迫切需要尋找新的治療方法。強(qiáng)力霉素是一種長效類四環(huán)素類抗生素，近年來發(fā)現(xiàn)強(qiáng)力霉素不但能夠抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，還是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的有效抑制劑，并且已經(jīng)被應(yīng)用于多種癌細(xì)胞的研究[1-2]。Notch信號(hào)通路作為一種進(jìn)化保守的細(xì)胞間相互作用機(jī)制，在細(xì)胞的增殖和分化中起重要作用，與胃癌的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系[3]。本研究觀察強(qiáng)力霉素對(duì)人胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期及Notch1、MMP-9表達(dá)的影響，初步探討其可能的機(jī)制，為強(qiáng)力霉素治療胃癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人胃癌細(xì)胞株（BGC-823）由北京大學(xué)郁衛(wèi)東老師饋贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)根據(jù)強(qiáng)力霉素濃度不同分為5組，分別為空白對(duì)照組，藥物終濃度為5、10、20、40 mg/L組。

1.2 主要試劑 強(qiáng)力霉素（sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），培養(yǎng)基（美國GiBico公司），青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶（華美生物工程有限公司），Notch1抗體（ABCAM公司），MMP-9抗體（武漢博士德生物工程有限公司），二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司），噻唑藍(lán)（MTT，Amresco公司），PI染色液，70%乙醇，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中（100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素），在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 藥物對(duì)細(xì)胞增殖作用的測定 采用MTT法。將細(xì)胞濃度調(diào)整為每孔細(xì)胞數(shù)為4×104，每孔200 μL，接種于96孔板，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。過夜后，分別加入含有不同濃度強(qiáng)力霉素的培養(yǎng)液，終濃度分別為5、10、20、40 mg/L，對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)液，每一濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上，以波長570 nm測定各孔吸光度（A）值。強(qiáng)力霉素對(duì)細(xì)胞生長的抑制率（IR）=（1-實(shí)驗(yàn)組A570nm/對(duì)照組A570nm）× 100%。以時(shí)間為橫軸，抑制率為縱軸繪制生長曲線，觀察強(qiáng)力霉素對(duì)BGC-823細(xì)胞增殖的影響。

1.3.3 細(xì)胞周期分布檢測 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以不同濃度強(qiáng)力霉素作用于細(xì)胞，對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，離心后PBS洗2遍，每管加入70%乙醇1 mL，將細(xì)胞輕輕吹起。4℃固定12 h，離心、棄固定液，用PBS重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入流式管，再次離心、棄上清，將每管中加入PI染色液，室溫避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.3.4 Notch1和MMP-9蛋白表達(dá)測定 采用Western Blot法。以不同濃度強(qiáng)力霉素作用于細(xì)胞，對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，各組細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液RIPA，提取出細(xì)胞總蛋白，蛋白量根據(jù)Lowery法進(jìn)行測定。以每個(gè)樣品50 μg總蛋白的量準(zhǔn)確點(diǎn)樣，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜。用含2%胎牛血清白蛋白（BSA）的Tris緩沖鹽溶液（TBST）封閉2 h，加入一抗兔抗人Notch1 IgG（1∶1 000），兔抗人MMP-9 IgG（1∶100），4℃孵育過夜，用TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG（1∶1 000），室溫下水平搖動(dòng)2 h，洗膜3次，用化學(xué)發(fā)光法（ECL）進(jìn)行顯色，曝光。以β-Actin抗體作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及重復(fù)測量資料的方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，相關(guān)性比較采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 強(qiáng)力霉素對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響 在一定范圍內(nèi)，不同濃度、不同時(shí)間的強(qiáng)力霉素組處理后均對(duì)胃癌細(xì)胞的生長起抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分組=22.050，F(xiàn)時(shí)間=617.376，F(xiàn)交互=40.552，均P＜0.001），且隨著濃度的升高和作用時(shí)間的增強(qiáng)，其抑制作用加強(qiáng)，即強(qiáng)力霉素抑制胃癌細(xì)胞BGC-823呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系，見圖1。

2.2 強(qiáng)力霉素對(duì)細(xì)胞周期的影響 強(qiáng)力霉素作用于胃癌細(xì)胞48 h后，5、10、20、40 mg/L組G0/G1期比例較對(duì)照組逐漸增加，而S期和G2/M期比例下降（P＜0.05）。強(qiáng)力霉素可將BGC-823細(xì)胞阻滯于G0/ G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，見表1。

Figure 1 The inhibitory effect of doxycycline on BGC-823 cell line圖1 強(qiáng)力霉素對(duì)BGC-823細(xì)胞的抑制效應(yīng)

Table 2 Effect of different concentrations of doxycycline on cell cycle distribution表1 不同濃度強(qiáng)力霉素作用48 h后細(xì)胞周期分布檢測結(jié)果 （n=6，%±s）

Table 2 Effect of different concentrations of doxycycline on cell cycle distribution表1 不同濃度強(qiáng)力霉素作用48 h后細(xì)胞周期分布檢測結(jié)果 （n=6，%±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，d與（4）組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組（1）強(qiáng)力霉素5 mg/L組（2）強(qiáng)力霉素10 mg/L組（3）強(qiáng)力霉素20 mg/L組（4）強(qiáng)力霉素40 mg/L組（5）F G0/G1期38.23±0.33 47.85±0.58a56.51±0.46ab62.25±0.57abc67.06±0.62abcd892.530＊＊S期31.56±0.41 24.83±0.62a18.46±0.48ab15.72±0.37abc12.37±0.56abcd949.002＊＊G2/M期30.21±0.61 27.32±0.57 25.03±0.66a22.03±0.61ab20.57±0.72abc139.190＊＊

2.3 Notch1和MMP-9蛋白表達(dá) 不同濃度強(qiáng)力霉素作用胃癌細(xì)胞48 h后，在一定范圍內(nèi)隨著強(qiáng)力霉素濃度增加，Notch1的表達(dá)增強(qiáng)，MMP-9的表達(dá)降低，見表2、圖2。Notch-1與MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.994,P＜0.05）。

Table 2 The Expression of Notch1 and MMP-9表2Notch1和MMP-9蛋白表達(dá)結(jié)果（n=6±s）

Table 2 The Expression of Notch1 and MMP-9表2Notch1和MMP-9蛋白表達(dá)結(jié)果（n=6±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，d與（4）組比較，P＜0.01

組別對(duì)照組（1）強(qiáng)力霉素5 mg/L組（2）強(qiáng)力霉素10 mg/L組（3）強(qiáng)力霉素20 mg/L組（4）強(qiáng)力霉素40 mg/L組（5）F Notch1 0.407 2±0.003 0 0.514 5±0.002 6a0.625 3±0.002 5ab0.682 6±0.003 6abc0.736 8±0.002 3abcd6 661.907＊＊MMP-9 0.937 8±0.003 1 0.825 6±0.002 7a0.633 4±0.003 2ab0.518 3±0.003 3abc0.434 6±0.003 4abcd13 419.911＊＊

3 討論

3.1 強(qiáng)力霉素的作用機(jī)制 近年來，強(qiáng)力霉素的非抗菌作用得到了較多研究，已應(yīng)用于腫瘤[1-2]、骨關(guān)節(jié)炎[4]和動(dòng)脈粥樣硬化治療[5]等多方面。強(qiáng)力霉素是MMPs的有效抑制劑。MMPs是一種鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，其中，MMP-9是MMPs中分子質(zhì)量最大的酶，可降解基底膜，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新生血管的延伸創(chuàng)造了必要條件，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的生長和擴(kuò)散[6]。目前，強(qiáng)力霉素抑制MMPs的機(jī)制并不是十分清楚，有研究認(rèn)為可能與強(qiáng)力霉素的Ca2+、Zn2+結(jié)合能力有關(guān)，其通過形成螯合物消除了MMPs的催化活化位點(diǎn)，從而抑制MMPs[7]。

Figure 2 Effect of different concentrations of doxycycline on Notch1 and MMP-9 expression圖2 不同濃度強(qiáng)力霉素對(duì)Notch1和MMP-9表達(dá)的影響

3.2 Notch1信號(hào)通路的可能作用機(jī)制 Notch信號(hào)通路的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)可引起人體較大范圍的障礙，包括發(fā)育綜合征、癌癥[8]等。該信號(hào)通路有4種受體（Notch1～4）和5種配體（Jagged1、Jagged2、Deltalike1、Delta-like3、Delta-like4），其中Notch1與Jagged1為最重要的受體和配體。Notch1的胞外域與Jagged1結(jié)合后可促進(jìn)Notch1胞內(nèi)活性域NICD釋放，NICD進(jìn)入核內(nèi)后誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄。趙娜等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Notch1低表達(dá)可能誘導(dǎo)核因子（NF）-κB高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。并且通過對(duì)MMPs基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在MMPs基因啟動(dòng)子近端調(diào)控區(qū)有特異性的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，去除NF-κB結(jié)合位點(diǎn)后可使MMPs表達(dá)降低[10]。

3.3 強(qiáng)力霉素通過Notch信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞增殖可能性機(jī)制 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)強(qiáng)力霉素對(duì)胃癌細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用，并且具有時(shí)間、濃度依賴性，這與謝兆蘭等[11]的報(bào)道一致；不同濃度強(qiáng)力霉素作用胃癌細(xì)胞48 h后，隨著濃度的增加，強(qiáng)力霉素可以上調(diào)Notch1蛋白的表達(dá)，抑制MMPs的表達(dá)，因此推測強(qiáng)力霉素可能通過促進(jìn)Notch信號(hào)通路來抑制NF-κB的表達(dá)，從而進(jìn)一步抑制MMPs的表達(dá)來發(fā)揮抗癌作用。

本研究似可為胃癌治療提供新的可能方法，然而將四環(huán)素類MMPs抑制劑應(yīng)用于胃癌的臨床治療仍舊有很長的路需要探索。

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（2013-11-08收稿 2014-02-14修回）

（本文編輯 李鵬）

Effect of Doxycycline on Gastric Cancer Cell Proliferation and Notch1,MMP-9 Expression

XU Min，LI Hong
Department of Biochemistry,Liaoning Medical College,Jinzhou,Liaoning 121000,China

ObjectiveTo investigate the effect of Doxycycline on gastric cancer cell line BGC-823 proliferation and Notch1,Matrix metalloproteinase-9（MMP-9）expression in order to shine a light on new anticancer drugs.MethodsFinal concentration of 0,5,10,20,40 mg/L doxycycline were added into human gastric cancer cell line BGC-823.Cell proliferation was detected by MTT;Cell cycle distribution was assessed by flow cytometry;Notch1,MMP-9 protein expression was revealed by Immunoblot.ResultsDoxycycline can inhibit proliferation of human gastric cancer cells line BGC-823, and its effect is dose and time-dependent（P＜0.01）.Doxycycline alters distribution of gastric cancer cell line BGC-823. With increasing drug concentration,the proportion of cells in S phase dropped（P＜0.01）.Notch1 expression rose and MMP-9 expression decreased（P＜0.01）.ConclusionDoxycyclinecan inhibited gastric cancer cell line BGC-823 proliferation and up-regulating Notch1 might be one mechanisms.

stomach neoplasms；cell line,tumor；receptor,Notch1；matrix metalloproteinase 9；cell proliferation；cell cycle；DOXYCYCLINE

R735.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.006

*遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201102125）

遼寧錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室（郵編121001）

△通訊作者 E-mail：jzmu-lihong@sina.com