孫蓮蓮 李長春 姜忠敏 盛 鳳 李艷霞 劉曉智△

碳酸飲料對乳恒牙更替期牙齒健康的影響*

孫蓮蓮1李長春1姜忠敏2盛 鳳3李艷霞3劉曉智3△

目的 研究碳酸飲料對乳恒牙更替期牙齒健康的影響作用及機(jī)制。方法40顆犬牙釉質(zhì)樣本分別采用15 μL可口可樂（可口可樂組）、雪碧（雪碧組）、純蘇打水（蘇打水組）和生理鹽水（生理鹽水組）浸泡，各10顆。測定處理后飲料中鈣、磷溶出濃度；分離牙乳頭干細(xì)胞，以添加可口可樂、雪碧、蘇打水和生理鹽水的條件培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，采用PCR法和Western blot法檢測核因子-κB受體活化劑配體（RANKL）、骨保護(hù)素（OPG）和維生素D受體（VDR）的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果各組鈣、磷溶出濃度（mmol/L）由高到低均依次為：雪碧組（3.679±0.114、0.089±0.008）、可口可樂組（2.217±0.109、0.036±0.005）、生理鹽水組（0.021±0.004、0.009±0.001）和蘇打水組（0.007± 0.001、0.002±0.000）。各組RANKL的mRNA和蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蘇打水組和生理鹽水組OPG的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于可口可樂組和雪碧組（均P＜0.05），雪碧組與可口可樂組、生理鹽水組與蘇打水組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生理鹽水組VDR的mRNA和蛋白表達(dá)水平低于可口可樂組和雪碧組，高于蘇打水組（均P＜0.05）。結(jié)論碳酸飲料可能通過調(diào)控成骨相關(guān)基因表達(dá)及維生素D受體家族共同影響乳恒牙更替期的牙齒健康。

碳酸鹽飲料；RANK配體；骨保護(hù)素；受體,骨化三醇；牙乳頭干細(xì)胞，維生素D受體

乳恒牙更替期是兒童牙齒生長發(fā)育過程中的關(guān)鍵階段，但目前人們對這一期間發(fā)生的一系列生理變化機(jī)制認(rèn)識(shí)有限。探索兒童乳恒牙更替發(fā)生發(fā)展過程中的內(nèi)在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)日常飲食中潛在的危險(xiǎn)因素，尋找針對性的治療和預(yù)防措施至關(guān)重要。碳酸飲料因含有糖及酸性成分，長期飲用會(huì)使牙齒受到侵蝕，引起“酸蝕癥”。兒童牙齒的牙釉質(zhì)處于未成熟階段，對抗酸腐蝕的能力較低，pH值在2.2～4.9間的大多數(shù)碳酸飲料可導(dǎo)致兒童牙齒的礦質(zhì)和釉質(zhì)流失，牙齒齲壞的概率大大增加[1]。本研究以牙乳頭干細(xì)胞為對象，通過模擬兒童乳恒牙更替期碳酸飲料對乳恒牙的作用特點(diǎn)，探索其內(nèi)部可能存在的調(diào)控機(jī)制，以及碳酸飲料對兒童發(fā)育期乳牙脫落及恒牙萌發(fā)、生長的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 胎牛血清（杭州四季青），DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Invitrogene公司）；可口可樂、雪碧、純蘇打水為市售合格產(chǎn)品；核因子-κB受體活化劑配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）多克隆抗體（美國Chemicon公司），骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）多克隆抗體及維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。實(shí)驗(yàn)犬牙齒由當(dāng)?shù)剞r(nóng)場提供。

1.2 犬牙釉質(zhì)樣本的制備 取新鮮拔除的犬下頜切牙48顆，去除牙根及牙髓組織，用無氟石英粉磨去釉質(zhì)表面菌斑及色素，流水沖洗干凈。經(jīng)體視顯微鏡檢查無裂痕、缺隙者共40顆，置于去離子水中，于-20℃冰箱中保存、備用。

1.3 飲料處理牙釉質(zhì)后鈣、磷濃度的測定 采用完全隨機(jī)法將40顆犬牙分為可口可樂組、雪碧組、蘇打水組和生理鹽水組，各10顆。用0.5 mol/L的過氯酸酸蝕暴露的釉質(zhì)面30 s，分別取15 μL可口可樂、雪碧、純蘇打水和生理鹽水滴加于釉質(zhì)面，于37℃處理牙釉質(zhì)，5次/d，5 min/次，處理后的飲料收集于EP管中。處理間隙置于生理鹽水中過夜。7 d后將收集的同一種飲料混合。每10 μL飲料加入280 μL的鈣、磷反應(yīng)液，振蕩混勻后立即于自動(dòng)微板讀數(shù)儀，于630 nm處測定鈣和磷的吸光度值（A），同期做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算鈣、磷溶出濃度C濃度=（A-1.648）/137.36。

1.4 牙乳頭干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將來自犬上下頜的第二磨牙牙胚置于培養(yǎng)液中，完整分離牙乳頭和成釉器，參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行乳頭干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。

1.5 牙乳頭干細(xì)胞在條件培養(yǎng)液中的培養(yǎng) 以可口可樂、雪碧、蘇打水和生理鹽水為添加劑，配制條件培養(yǎng)液進(jìn)行牙乳頭干細(xì)胞的培養(yǎng)。其他細(xì)胞培養(yǎng)方式同1.4。

1.6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR循環(huán)反應(yīng)。利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)合成上游引物和下游引物序列。β-actin作為內(nèi)參對照。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃45 s，60℃60 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。取15 μL反應(yīng)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀測并記錄反應(yīng)結(jié)果。RANKL上游引物：5′-GAGACTACGGCAAGTA-3′；下游引物：5′-CCTCCAACGTTTATGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為822 bp。OPG上游引物：5′-TGGAGCTCGAATTCTGCTTG-3′；下游引物：5′-CATCAAGATGCGGAGC TGCT-3′，引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為603 bp。VDR上游引物：5′-ACCCCCACTGAAAAAGATA-3′；下游引物：5′-CCGTGAATTCGCACCGCACAG-3′，擴(kuò)增片段為306 bp。βactin上游引物：5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′；下游引物：5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGCA-3′，引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為410 bp。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[2]，采用Western blot檢測RANKL、OPG和VDR的蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同碳酸飲料處理牙釉質(zhì)對鈣、磷溶出濃度的影響 各組鈣、磷溶出濃度由高到低均依次為：雪碧組、可口可樂組、生理鹽水組和蘇打水組；組間多重比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

Table 1 Comparison of dissolution concentration of calcium and scale between all groups表1 各組鈣、磷溶出濃度比較（mmol/L，n=10，±s）

Table 1 Comparison of dissolution concentration of calcium and scale between all groups表1 各組鈣、磷溶出濃度比較（mmol/L，n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與可口可樂組比較，b與雪碧組比較，c與蘇打水組比較，P＜0.05

組別可口可樂組雪碧組蘇打水組生理鹽水組F鈣磷2.217±0.109 3.679±0.114a0.007±0.001ab0.021±0.004abc21.835＊＊0.036±0.005 0.089±0.008a0.002±0.000ab0.009±0.001abc15.664＊＊

2.2 碳酸飲料對RANKL、OPG和VDR mRNA表達(dá)的影響 各組RANKL mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蘇打水組和生理鹽水組OPG mRNA表達(dá)水平均高于可口可樂組和雪碧組（均P＜0.05），雪碧組與可口可樂組、生理鹽水組與蘇打水組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生理鹽水組VDR mRNA表達(dá)水平低于可口可樂組和雪碧組，高于蘇打水組（均P＜0.05），雪碧組與可口可樂組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

2.3 碳酸飲料對RANKL、OPG和VDR蛋白表達(dá)的影響 各組RANKL蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蘇打水組和生理鹽水組OPG蛋白質(zhì)表達(dá)水平均高于可口可樂組和雪碧組（均P＜0.05），雪碧組與可口可樂組、生理鹽水組與蘇打水組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生理鹽水組VDR蛋白表達(dá)水平低于可口可樂組和雪碧組，高于蘇打水組（均P＜0.05），雪碧組與可口可樂組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

3 討論

成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在骨科領(lǐng)域被廣泛研究，二者間的動(dòng)態(tài)平衡影響兒童骨骼發(fā)育以及成人病理狀態(tài)下的骨吸收與增殖異常[3]。RANKL又稱為骨保護(hù)素配體及破骨細(xì)胞分化因子，在骨骼中的主要作用為刺激破骨細(xì)胞的分化和活性，抑制破骨細(xì)胞的凋亡。RANKL過表達(dá)可導(dǎo)致一系列骨疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎等[4]。OPG的主要作用是抑制破骨細(xì)胞的形成和活性，OPG治療可預(yù)防骨質(zhì)疏松和血管鈣化及逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松[5]。乳恒牙更替是兒童牙齒生長發(fā)育的一個(gè)重要階段，此階段乳牙牙髓、牙周膜、牙槽骨以及繼承恒牙胚等組織內(nèi)均發(fā)生一系列變化，并需要有分化成熟的破骨細(xì)胞吸收乳牙根、牙槽骨等組織，為恒牙胚的發(fā)育和萌出開辟空間，使得乳恒牙實(shí)現(xiàn)順利替換。基于以上理論，本研究以犬乳恒牙更替期飲用碳酸飲料的作用特點(diǎn)，研究破骨及成骨相關(guān)基因RANKL和OPG的表達(dá)變化，探索在上述基因間可能存在的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，以及碳酸飲料可能在兒童發(fā)育期對乳牙脫落及恒牙萌發(fā)、生長的影響。

Figure 1 Effect of the carbonated drinks on mRNA、transcription of some genes圖1各組RANKL、OPG和VDR的mRNA表達(dá)比較

Figure 2 Effect of the carbonated drinks on some protein expression圖2 各組RANKL、OPG和VDR蛋白表達(dá)比較

可口可樂和雪碧為酸性飲料，純蘇打水為堿性溶液[6]。本研究結(jié)果顯示，可口可樂組和雪碧組鈣、磷溶出濃度均高于生理鹽水組，蘇打水組鈣、磷溶出濃度低于生理鹽水組，提示酸性碳酸飲料具有明顯的脫鈣與脫磷作用；而堿性飲料則表現(xiàn)出一定的鈣、磷保護(hù)作用，可在一定程度上抑制上述反應(yīng)。由于雪碧的pH值高于可口可樂[7]，但其脫鈣與脫磷作用最為明顯，提示酸堿度不是影響脫鈣與脫磷作用的唯一因素。為進(jìn)一步探索其可能存在的分子機(jī)制，本研究通過分離牙乳頭干細(xì)胞，以添加3種飲料的條件培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種飲料對RANKL基因的mRNA和蛋白水平均無影響；可口可樂和雪碧可降低OPG的表達(dá)水平，但純蘇打水對OPG基因的表達(dá)無明顯影響。提示日常飲用的碳酸飲料幾乎不會(huì)影響牙乳頭干細(xì)胞中RANKL的功能，但酸性飲料可降低OPG的表達(dá)，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)平衡。

由于在上述結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)碳酸飲料可影響OPG的表達(dá)，但作用較輕微，筆者推測碳酸飲料可能通過其他機(jī)制共同影響兒童乳恒牙更替期的牙乳頭干細(xì)胞的生長。因此本研究選擇對鈣、磷調(diào)節(jié)起重要作用的VDR為研究對象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明可口可樂和雪碧可同時(shí)升高VDR基因的表達(dá)，純蘇打水則可明顯降低VDR基因的表達(dá)水平。提示VDR可能在此調(diào)控過程中發(fā)揮了更為積極的作用，但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，碳酸飲料可能通過調(diào)控成骨相關(guān)基因表達(dá)及維生素D受體家族共同影響兒童乳恒牙更替期的牙齒健康。

[1]Liu H,Cao T.Dental application potential of mesenchymal stromal cells and embryonic stem cells[J].Chin J Dent Res,2010,13(2):95-103.

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（2013-09-01收稿 2013-12-20修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effect of Carbonated Drinks on Primary and Permanent Teeth Replacement in Children

SUN Lianlian1,LI Changchun1,JIANG Zhongmin2,SHENG Feng3,LI Yanxia3,LIU Xiaozhi3
1 Department of Stomatology,2 Department of Pathology,3 the Central Laboratory，the Fifth Central Hospital of Tianjin, Tianjin 300450,China

ObjectiveTo study the effect of carbonated drinks on primary and permanent teeth replacement in Children.Method Dog tooth enamel samples were soaked in coca-cola,sprite and pure soda,and the calcium,phosphorus level were analysed.Dental papilla stem cells were separated and cultured in the conditioned medium by adding three drinks. PCR and western blot were used to detect mRNA and protein levels of activator of nuclear factor-k B receptor ligand (RANKL),osteoprotegerin(OPG)and vitamin D receptor(VDR),then the possible role of each gene and interactions relationship were analyzed.ResultsCompared with saline,coca-cola and sprite showed their significantly decalcification and dephosphorization role,while plain soda water showed calcium and phosphorus protective effect.These three drinks had no effect on mRNA and protein levels of RANKL gene(P＞0.05).Coca-cola and sprite can reduce OPG mRNA and protein levels,and at the same time increase transcription and expression of the VDR gene.Plain soda water has no effect on the OPG gene manifestation,but can significantly reduce the transcription and translation level of the VDR gene.ConclusionCarbonated drinks may affect the dental health of the children's primary and permanent teeth replacement by regulating bone related gene expression and vitamin D receptor family.

carbonated beverages;RANK ligand;osteoprotegerin;receptors,calcitriol;dental papilla stem cells;vitamin D receptor

R788

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.015

*天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2011KZ25）

1天津市第五中心醫(yī)院口腔科(郵編300450),2病理科, 3中心實(shí)驗(yàn)室

△通訊作者 E-mail：lxz7997@126.com