高廣榮，張 成，張雪峰

沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院普通外科，遼寧沈陽(yáng) 110016

意外創(chuàng)傷后的失血性休克是導(dǎo)致傷員死亡的主要原因，及時(shí)的液體復(fù)蘇是挽救傷員生命的最主要措施。在復(fù)蘇過(guò)程中如何減輕因缺血再灌注所導(dǎo)致的臟器損傷，提高復(fù)蘇療效是目前臨床和基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，溶血磷脂酸可能利于休克的復(fù)蘇。本文通過(guò)建立壓力控制性失血性休克模型，采用復(fù)蘇階段藥物干預(yù)的方法觀察溶血磷脂酸是否對(duì)失血性休克器官損傷起到保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)成年雄性Wistar大鼠(體重280～310 g)30只，沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。Datex-Ohmeda S/5多功能監(jiān)測(cè)儀(芬蘭德恩公司)，壓力傳感器(新加坡 Biosensors International PET，Ltd)。ELISA試劑盒。

1.2 動(dòng)物分組與模型制備 30只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為空白對(duì)照組(C)、失血性休克 +磷酸鹽緩沖液(PBS)復(fù)蘇組(S)、失血性休克+溶血磷脂酸(LPA)復(fù)蘇組(L)。C組只進(jìn)行外科插管操作，不進(jìn)行失血性休克模型建立及復(fù)蘇。S組和L組按照標(biāo)準(zhǔn)建立壓力控制失血性休克模型［1］。以10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉。進(jìn)行雙側(cè)股動(dòng)脈及右側(cè)股靜脈插管(PE-50)。右側(cè)股動(dòng)脈用于監(jiān)測(cè)血壓，左側(cè)股動(dòng)脈用于放血，右側(cè)股靜脈用于復(fù)蘇。所有外科操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。外科操作結(jié)束后經(jīng)過(guò)15 min穩(wěn)定期，然后記錄基礎(chǔ)平均動(dòng)脈壓(MAP)。建立模型時(shí)，通過(guò)左側(cè)股動(dòng)脈插管在10 min內(nèi)抽血使MAP降至40 mmHg。抽出的血液儲(chǔ)存在肝素化(7.5 U/ml)的無(wú)菌注射器內(nèi)，儲(chǔ)存于4℃冰箱中，待復(fù)蘇時(shí)回輸至大鼠體內(nèi)。在休克觀察的90 min內(nèi)通過(guò)繼續(xù)抽血或少量回輸抽出的血液來(lái)維持大鼠MAP在40～45 mmHg。休克90 min結(jié)束后分別給予S組及L組靜脈注射PBS 1 ml或LPA 1 mg，然后將抽出的血液及等體積生理鹽水通過(guò)右側(cè)股靜脈在10 min內(nèi)用微量輸液泵回輸至大鼠體內(nèi)，連續(xù)觀察240 min。各組大鼠在外科操作結(jié)束后持續(xù)測(cè)量直腸溫度，如果直腸溫度低于37℃，即開(kāi)始用紅外線燈照射大鼠腹部，在實(shí)驗(yàn)觀察期間通過(guò)間斷照射紅外線燈維持大鼠直腸溫度在37～38℃，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 標(biāo)本留取 各組在失血性休克復(fù)蘇后240 min處死大鼠，留取大鼠肺臟和肝組織2塊，各100 mg，分別置于4%甲醛溶液及－80℃低溫冰箱待測(cè)。留取血清3 ml置于－80℃低溫冰箱待測(cè)。

1.4 樣本檢測(cè) ELISA法檢測(cè)血清TNF-α及肺組織MPO濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清 ALT、AST濃度。蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測(cè)大鼠肺組織病理改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活情況 C組大鼠全部存活，S組大鼠有2只死亡，L組大鼠有1只死亡。

2.2 肺組織MPO含量(U/100 mg肺組織)變化S組和L組大鼠肺組織MPO含量均明顯高于C組(P﹤0.05)。但L組大鼠肺組織MPO含量明顯低于S組(P﹤0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠肺組織MPO含量變化

2.3 血清TNF-α含量變化(pg/ml) S組和L組大鼠血清中 TNF-α含量均明顯高于 C組(P﹤0.05)。但L組大鼠肺血清中TNF-α含量明顯低于S組(P﹤0.05)。見(jiàn)圖2。2.4 血清ALT濃度(U/L)變化 S組和L組大鼠血清中ALT濃度均明顯高于C組(P﹤0.05)。但L組大鼠肺血清中ALT濃度明顯低于S組(P﹤0.05)。見(jiàn)圖3。

圖2 3組大鼠血清中TNF-α含量變化

圖3 3組大鼠血清ALT含量變化

2.5 血清AST濃度(U/L)變化 S組和L組大鼠血清中AST濃度均明顯高于C組(P﹤0.05)。但L組大鼠肺血清中AST濃度明顯低于S組(P﹤0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 3組大鼠血清AST含量變化

2.6 肺組織病理學(xué)變化 通過(guò)石蠟切片可見(jiàn)，C組大鼠肺組織內(nèi)無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)未見(jiàn)滲出液。S組大鼠肺組織內(nèi)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡內(nèi)大量滲液。而L組肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯輕于S組。

3 討論

溶血磷脂酸(1ysophosphatidic acid，LPA)是膜磷脂經(jīng)磷脂酶D和磷脂酶A降解生成的細(xì)胞間磷脂類(lèi)信號(hào)分子，是一種結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的水溶性甘油磷脂。LPA與其受體結(jié)合后具有刺激細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)血液凝固等廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，體內(nèi)多種組織細(xì)胞均產(chǎn)生LPA，血液循環(huán)的LPA水平主要由血小板的產(chǎn)生和釋放來(lái)決定［2］。研究發(fā)現(xiàn)，LPA與心腦血管意外密切相關(guān)，動(dòng)脈粥樣硬化和腦梗塞患者體內(nèi)LPA明顯升高［3］。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，外源性LPA能夠減輕因內(nèi)毒素性休克所導(dǎo)致的大鼠肝損傷，抑制肝組織內(nèi)TNF-α基因的表達(dá)，降低炎癥因子的水平，利于內(nèi)毒性休克的救治［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，外源性LPA能夠通過(guò)抑制腎小球細(xì)胞凋亡及抑制補(bǔ)體活性而減輕因缺血再灌注所導(dǎo)致的腎損傷，具有保護(hù)腎功能的作用［5］。以上研究證實(shí)，LPA具有減輕炎癥反應(yīng)的作用。

創(chuàng)傷失血性休克同內(nèi)毒性休克一樣，也能夠刺激機(jī)體釋放過(guò)量的炎癥介質(zhì)，使休克機(jī)體發(fā)生全身性炎癥反應(yīng)綜合征，最終發(fā)生多器官功能障礙綜合征［6］。目前LPA對(duì)失血性休克后的炎癥反應(yīng)影響報(bào)道較少，是否對(duì)失血性休克所導(dǎo)致的臟器損傷有保護(hù)作用有待進(jìn)一步研究。

本次研究表明，失血性休克復(fù)蘇后4h大鼠血清中ALT、AST濃度明顯升高，提示出現(xiàn)了肝臟的缺血再灌注損傷，而復(fù)蘇前靜脈注射LPA組大鼠血清ALT、AST濃度較PBS組明顯下降，表明LPA具有減輕因失血性休克復(fù)蘇所造成的肝臟缺血再灌注損傷，利于休克的復(fù)蘇。

作為中性粒細(xì)胞募集的標(biāo)志，MPO是反映肺內(nèi)急性炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)。本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)，失血性休克復(fù)蘇后大鼠肺組織內(nèi)MPO濃度明顯升高，休克復(fù)蘇前應(yīng)用LPA組大鼠肺組織內(nèi)MPO濃度顯著降低。結(jié)果表明，LPA能夠減輕失血性休克后肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)石蠟病理切片也證實(shí)LPA組大鼠肺組織內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺泡腔內(nèi)滲出明顯減輕，肺間質(zhì)水腫也明顯減輕。以上結(jié)果均表明，LPA減輕了因失血性休克所導(dǎo)致的肺損傷。

TNF-α是重要的促炎因子，以往的研究已經(jīng)證實(shí)TNF-α是失血性休克后機(jī)體早期釋放的促炎因子，發(fā)揮著促炎作用，TNF-α的大量釋放能夠刺激機(jī)體釋放更多的促炎介質(zhì)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致器官的嚴(yán)重?fù)p傷。減輕TNF-α的濃度將利于休克的復(fù)蘇。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了大鼠血清中TNF-α的濃度，證實(shí)LPA組大鼠血清中TNF-α濃度明顯降低，證實(shí)LPA能夠抑制失血性休克大鼠體內(nèi)的TNF-α的濃度，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用外源性LPA能夠減輕失血性休克復(fù)蘇后所導(dǎo)致大鼠肝、肺等臟器損傷，減輕失血性休克后的炎癥反應(yīng)，利于休克的復(fù)蘇。但尚不清楚LPA通過(guò)何種途徑發(fā)揮抗炎作用及臟器保護(hù)作用，有待深入研究。

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