周潔，朱雁林，董建勇，傅紅興，裘關關，方亮蓮，林濰濰

（溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

糖尿病潰瘍是常見的糖尿病慢性并發(fā)癥之一，糖尿病患者中，潰瘍的發(fā)病率約占4%～10%，是導致糖尿病患者致殘和早亡的主要原因[1]，也是醫(yī)療費增加的主要因素[2-3]，患者皮膚損傷后創(chuàng)面愈合延遲或不愈合成為臨床亟待解決的難點和熱點[4]。研究表明，活血化瘀藥在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的內(nèi)環(huán)境及其分泌功能，逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮功能方面已取得較大進展[5]。

溫莪術是臨床上較為常用的活血化瘀藥物，從其藥用部位莪術油中提取的成分莪術醇具有抗腫瘤、抗炎、抗纖維化、抗氧化、促進血管生成及低細胞毒性特點[6-9]。本研究通過使用自制的莪術醇軟膏，比較糖尿病大鼠與正常大鼠皮膚潰瘍愈合情況及皮膚中膠原含量、內(nèi)皮細胞黏附分子（CD31）及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的表達差異，探討其在糖尿病潰瘍創(chuàng)面修復中的作用，為將來該莪術醇軟膏的臨床應用提供實驗參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SD雄性大鼠48只，體質(zhì)量180～220 g，由上海斯萊克實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，單籠飼養(yǎng)，恒溫18～22℃，恒濕，自由飲水、攝食。本實驗征得溫州醫(yī)科大學動物倫理委員會同意。

1.1.2 試劑和儀器：莪術醇由本實驗室從莪術油中分離得到，經(jīng)氣相色譜鑒定純度為99.3%；鏈脲佐菌素（Steptozocin，STZ）（美國Sigma公司）；羅氏血糖儀（德國羅氏公司）；電子分析天平（AL-104，瑞士Mettler Toledo公司）；HE染色試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Masson三色染色試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；兔抗鼠CD31多克隆抗體（克隆號：M-20，稀釋倍數(shù)：1:50，Santa Cruz公司，德國）；兔抗鼠TGF-β1一抗（美國Santa Cruz公司）；RM 2135超薄切片機（德國萊卡leica公司）；EC 350-1石蠟包埋機（德國萊卡leica公司）；光學顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 軟膏的制備：將白凡士林、羊毛脂、液體石蠟按照10:1:1的配比加熱充分攪拌混合均勻，配成空白軟膏劑基質(zhì)，再稱取莪術醇混懸在少量超純水中后加入軟膏基質(zhì)中充分攪拌，分別制成5%和10%的含藥軟膏[10-12]。

1.2.2 糖尿病潰瘍造模：SD大鼠于實驗前適應性喂養(yǎng)1周，隨機抽取12只SD大鼠作為正常組，其余36只作為糖尿病造模組，過夜禁食13 h后，腹腔注射STZ（55 mg/kg），用pH 4.2的0.1 mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液配成10 mg/mL溶液，1周后尾靜脈采血測血糖，當血糖值≥16.7 mmol/L且伴隨出現(xiàn)“三多一少”癥狀者即為糖尿病造模成功[13]，再經(jīng)過1周觀測大鼠飲水飲食狀況并記錄血糖值后進行糖尿病潰瘍模型制作。

潰瘍制作方法[14]：10%水合氯醛0.3 mL/kg將大鼠麻醉，剔除背部毛發(fā)，再用脫毛膏去除殘余毛發(fā)，用75%乙醇消毒背部皮膚，用外科手術剪剪去背部脊柱兩側(cè)對稱部位直徑1.8 cm的圓形全層缺失皮膚創(chuàng)面，深至筋膜，止血后以無菌紗布包扎備用。1.2.3 動物分組及給藥：將造模成功的36只大鼠隨機分成3組：空白基質(zhì)組、5%莪術醇軟膏組、10%莪術醇軟膏組。單籠喂養(yǎng)每天固定時間給藥1次，給藥前用0.9%氯化鈉溶液清洗創(chuàng)面，莪術醇軟膏給藥以覆蓋創(chuàng)面為宜。

1.2.4 皮膚愈合指標的測定：給藥后每天觀察創(chuàng)傷表面及其周圍的炎癥反應、創(chuàng)傷的愈合情況，于創(chuàng)面給藥治療后第3、第7、第14和第21天分別對大鼠進行潰瘍創(chuàng)面拍照，用Image-Pro Plus 5.0軟件測定潰瘍創(chuàng)面面積，潰瘍愈合率計算公式：

創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%

1.2.5 皮膚標本采集：于給藥后第3、第7、第14和第21天分別取創(chuàng)面標本，每個時間點每組處死3只大鼠，取創(chuàng)面組織標本，固定在4%多聚甲醛中，留作病理學觀察及免疫組織化學指標檢測。

1.2.6 大鼠皮膚潰瘍面HE及Masson染色：取4%多聚甲醛里固定24 h后的標本，將其放入不同濃度乙醇水溶液中進行脫水，二甲苯透明后常規(guī)石蠟包埋縱向連續(xù)切片（5μm），行HE及Masson染色，顯微鏡下檢查創(chuàng)面組織的病理形態(tài)，肉芽組織增生情況及上皮組織的形成。

1.2.7 免疫組織化學：用CD31及TGF-β1免疫組織化學法分別探查創(chuàng)面組織的血管化和細胞增殖陽性表達率。取石蠟包埋標本，進行超薄切片（5μm），用1:5多聚賴氨酸處理過的載玻片進行撈片，撈片后于烘箱烘片4 h，再經(jīng)脫蠟至水、抗原修復和封閉后，切片上分別滴加一抗，37 ℃孵育1 h，隨后二抗孵育，最后用DAB顯色、蘇木素輕度復染、脫水、透明和封片。

判斷標準：顯微鏡下觀察到胞質(zhì)或胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，無棕黃色顆粒者為陰性結果。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗。多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 造模后血糖及體質(zhì)量變化 經(jīng)STZ造模后，兩組大鼠不同時期血糖和體質(zhì)量的變化情況見表1-2。糖尿病造模組大鼠血糖明顯高于正常組，體質(zhì)量較正常組增長緩慢，造模較為成功。

表1 兩組注射STZ后血糖濃度比較（±s，mmol/L）

與正常組比：aP＜0.05

組別 n 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天糖尿病造模組 3 6 2 0.8 2±2.0 5 a 2 1.8 0±1.8 4 a 2 2.5 9±2.2 8 a 2 2.4 7±2.2 4 a正常組 1 2 6.3 2±1.0 8 6.7 5±1.0 6 6.3 9±1.0 2 6.3 1±0.5 3

2.2 創(chuàng)面愈合情況及愈合率比較 在第3、第7、第14和第21天莪術醇軟膏促進創(chuàng)面愈合明顯快于空白基質(zhì)組（見圖1）。5%與10%兩種不同濃度的莪術醇軟膏相比較，隨著肉芽組織的大量形成和逐漸成熟，傷口逐漸縮小并逐漸愈合，且10%莪術醇軟膏組的愈合率高于5%莪術醇軟膏組，但兩者差異不明顯（P＞0.05），見表3。說明莪術醇軟膏刺激了上皮的再生化，促進了糖尿病潰瘍的創(chuàng)面愈合。

表2 兩組注射STZ后體質(zhì)量變化比較（±s，g）

表2 兩組注射STZ后體質(zhì)量變化比較（±s，g）

與正常組比：aP＜0.05

組別 n 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天糖尿病造模組 3 6 2 0 9.9±1 1.6 2 2 3.9±1 4.9 a 2 5 7.6±4 8.5 a 2 7 1.6±5 1.9 a正常組 1 2 2 0 3.8±7.3 2 5 5.8±1 5.2 3 4 8.3±2 8.4 3 8 3.5±3 9.2

表3 實驗性糖尿病潰瘍大鼠潰瘍愈合率（n=12，±s，%）

表3 實驗性糖尿病潰瘍大鼠潰瘍愈合率（n=12，±s，%）

與空白基質(zhì)組比：aP＜0.05

組別 第3天 第7天 第14天 第21天空白基質(zhì)組 10.1±7.3 40.8±12.5 80.4±7.5 90.5±2.7 5%莪術醇軟膏組 18.2±12.4a 61.7±5.2a 88.1±4.8a 95.6±1.5a 10%莪術醇軟膏組 18.1±11.2a 65.3±8.2a 90.4±8.9a 98.7±4.5a

圖1 各組創(chuàng)面愈合隨造模后時間的變化情況

2.3 病理組織學觀察

2.3.1 HE和Masson染色結果：創(chuàng)面組織的HE染色和Masson染色分別如圖2和圖3所示。

圖2 創(chuàng)傷后第3、第7、第14和第21天各組的HE染色比較（×200）

圖3 創(chuàng)傷后第3、第7、第14和第21天各組的Masson染色比較（×200）

5%莪術醇軟膏組：第3天時炎癥細胞出現(xiàn)浸潤；第7天時肉芽組織生成；第14天時上皮組織開始形成，炎癥細胞開始消退，成纖維細胞增加；第21天時創(chuàng)面基本上皮化，上皮層較空白基質(zhì)組厚。隨劑量加倍，10%莪術醇軟膏組與5%莪術醇軟膏組相比，第14天肉芽組織開始填充且在第21天時肉芽組織更厚，膠原纖維染色呈束狀排列且更為緊密規(guī)整。空白基質(zhì)組：第3天時可減少量炎癥細胞浸潤，膠原纖維排列疏松且不規(guī)則；第7天時可見炎癥細胞比第3天時多，炎癥細胞出現(xiàn)緩慢，且傷口有化膿現(xiàn)象；第14天時炎癥細胞聚集，膠原纖維和成纖維細胞形成少，創(chuàng)面上皮化較給藥組少。

2.3.2 CD31免疫組織化學：CD31的免疫組織化學將小血管的內(nèi)皮細胞膜染成棕色（見圖4）。創(chuàng)面組織的CD31的免疫組織化學結果如圖4所示。在造模給藥后第7天和第14天空白對照組和給藥組CD31表達量均有不同程度的提高，且在給藥10%莪術醇組CD31的表達量較多。在造模后第21天時，3組的CD31表達量都有所降低（見表4）。

圖4 創(chuàng)傷后第3、第7、第14和第21天各組CD31表達的比較(×200)

表4 3組CD31陽性表達率比較（n=12，±s，%）

表4 3組CD31陽性表達率比較（n=12，±s，%）

與空白基質(zhì)組比：aP＜0.05

組別 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天空白基質(zhì)組 1 6.8 7±6.0 1 2 3.4 3±6.0 9 3 2.0 0±4.1 0 2 7.6 3±3.0 5 5%莪術醇軟膏組 2 3.8 8±3.1 2 4 5.6 7±2.3 2 a 5 0.3 2±2.8 4 a 4 3.8 6±2.0 8 a 1 0%莪術醇軟膏組 3 3.0 1±3.1 1 5 0.3 0±2.0 9 a 5 9.2 2±1.2 4 a 5 3.3 0±6.0 7 a

2.3.3 TGF-β1免疫組織化學：TGF-β1可以作用于成纖維細胞，產(chǎn)生細胞增生分化，合成膠原蛋白，調(diào)節(jié)創(chuàng)傷中各細胞間的相互作用。創(chuàng)面組織TGF-β1的免疫組織化學結果如圖5所示。在造模后第7天，5%和10%莪術醇軟膏組均有促進TGF-β1的表達，且給藥組的表達量均高于空白基質(zhì)組。在給藥后第14天5%、10%莪術醇軟膏組TGF-β1表達量達到頂峰。第7天和第14天時10%莪術醇軟膏組的TGF-β1表達量高于5%莪術醇軟膏組，而在第21天時10%莪術醇軟膏組TGF-β1表達量較5%莪術醇軟膏組略有下降（見表5）。

圖5 創(chuàng)傷后第3、第7、第14和第21天后各組TGF-β1表達的比較（×200）

表5 3組TGF-β1陽性表達率比較（n=12，±s，%）

表5 3組TGF-β1陽性表達率比較（n=12，±s，%）

與空白基質(zhì)組比：aP＜0.05

組別 第3天 第7天 第1 4天 第2 1天空白基質(zhì)組 2.3 3±0.5 8 4.3 3±1.5 3 5.6 7±0.5 8 5.3 3±0.2 3 5%莪術醇軟膏組 3.6 7±1.5 3 8.0 0±2.6 5 a 1 6.6 7±1.1 5 a 1 5.0 0±1.0 4 a 1 0%莪術醇軟膏組 3.2 5±0.9 6 1 1.3 3±1.5 3 a 1 9.5 0±3.1 1 a 1 3.0 0±1.8 3 a

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織最新公布的數(shù)據(jù)顯示，我國已成為世界第一糖尿病大國，患病率為9.7%，已高于世界平均水平的6.4%[15]。作為糖尿病并發(fā)癥之一的糖尿病難愈合創(chuàng)面的修復不僅困擾著臨床醫(yī)生，也是醫(yī)學界面臨的重大難題[4]。其中皮膚組織中血管退化，創(chuàng)面中血管生成遲滯，可能是糖尿病創(chuàng)面難愈的重要原因[16]。利用血管活性藥物擴張血管，改善局部組織的微循環(huán)，增加氧供，在臨床上已有廣泛的應用[17]。臨床病理發(fā)現(xiàn)，從糖尿病足潰瘍中分離出的成纖維細胞其生理受損，分泌各類生長因子的功能降低，且增殖功能顯著降低[18]。因此刺激或修復創(chuàng)面成纖維細胞的增殖、遷移功能，進一步誘導膠原生成的治療也是促進糖尿病傷口愈合的研究方向。

傷口愈合是十分復雜的生物學過程，包括早期炎癥細胞聚集，多種細胞的增生，毛細血管的形成等。充分的血供為組織修復提供充分的營養(yǎng)物質(zhì)，保證了組織再生所需，有利于各種修復細胞增殖和發(fā)揮其功能活性，也是促進創(chuàng)面愈合創(chuàng)面微循環(huán)改善的重要標志[19]。而成纖維細胞在組織創(chuàng)傷修復過程中起保護創(chuàng)面、填補傷口等作用，因此，大量的成纖維細胞增殖及充分的血液循環(huán)是傷口愈合的關鍵。CD31可以探查創(chuàng)面組織血管化程度，創(chuàng)面的微血管組織中血管內(nèi)皮細胞迅速增殖，進而形成新生微小血管以滿足組織修復所需的營養(yǎng)與氧供，因此CD31陽性表達率是創(chuàng)面血管微循環(huán)改善的重要標志之一[20]。TGF-β1抗原表達多少與成纖維細胞增殖關系密切，是評價細胞增殖狀態(tài)較好的指標[21]。大量的成纖維細胞在創(chuàng)基內(nèi)增殖、遷移、分化，分泌大量的膠原基質(zhì)，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，充填組織缺損的同時與膠原基質(zhì)協(xié)同作用收縮創(chuàng)面。

在本實驗中，第3天時創(chuàng)面處于炎癥水腫期，創(chuàng)面肉芽組織生長在起始階段，3組間創(chuàng)面愈合率、膠原著色差異不明顯，CD31和TGF-β1陽性表達率均不明顯，5%和10%莪術醇軟膏組與空白基質(zhì)組相比差異不明顯；第7天時，從表觀上觀察3組創(chuàng)面面積都開始減小，傷口邊緣逐漸開始收縮，而5%和10%莪術醇軟膏組的潰瘍愈合率與空白基質(zhì)組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第14天時，3組處于潰瘍修復過程中肉芽組織填充期間，傷口中心可見有新生上皮，可觀察到給藥組血管增生現(xiàn)象較第3天明顯增強，10%莪術醇軟膏組CD31和TGF-β1陽性表達率均高于5%莪術醇軟膏組。此外成纖維細胞大量增殖，并開始分泌大量的膠原纖維。第21天時，10%莪術醇軟膏組創(chuàng)面接近于愈合，膠原纖維粗大，大量細長梭狀的纖維細胞呈束狀排列，CD31的表達量高于5%莪術醇軟膏組，但是TGF-β1表達量低于5%莪術醇軟膏組，而空白基質(zhì)組，纖維細胞少且排列不規(guī)則，有較多膠原纖維增生，但呈不規(guī)則分布，細胞間質(zhì)疏松明顯。

本實驗通過觀測糖尿病大鼠皮膚的愈合率，HE與Masson染色，及傷口愈合密切相關的病理組織學指標CD31、TGF-β1的陽性表達，發(fā)現(xiàn)莪術醇軟膏促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合可能是通過促進成纖維細胞增殖，以及膠原的合成，與新生的毛細血管等共同形成肉芽組織，填補傷口組織缺損，從而促進表皮細胞的覆蓋，達到傷口愈合的目的。且隨給藥濃度的加大，10%莪術醇軟膏較5%莪術醇軟膏能更快促進創(chuàng)面愈合，并在病理切片HE染色及免疫組織化學染色的結果中其膠原合成、CD31的陽性表達、TGF-β1蛋白陽性表達上更優(yōu)，與表觀愈合情況一致。當然，傷口愈合是一個極其復雜的過程，莪術醇軟膏是否通過其他途徑產(chǎn)生作用還有待于進一步研究。

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