馮 燕，朱珊麗，林曉云，薛向陽，李文姝，張麗芳

（溫州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，浙江溫州325035）

沙眼衣原體（Chlamydiatrachomatis，Ct）型別眾多，感染十分普遍，不僅是引起沙眼、致盲的主要原因，還可通過性接觸途徑引起男性尿道炎和女性宮頸炎[1]，因此也是性傳播感染（sexuallytransmittedinfections，STIs）的主要病原之一。Ct感染可導(dǎo)致不良妊娠，如異位妊娠、流產(chǎn)等[2]，且經(jīng)抗生素治療后極易復(fù)發(fā)。Ct在細(xì)胞內(nèi)完成獨(dú)特的雙相發(fā)育周期，即具有代謝惰性的感染性原體（elementarybody，EB）和代謝活躍的非感染性網(wǎng)狀體（reticulatebody，RB）。發(fā)育周期完成后，EB從細(xì)胞中釋放并感染鄰近的細(xì)胞，從而形成循環(huán)增殖[3]。

原體和許多其他革蘭陰性病原菌一樣，通過III型分泌系統(tǒng)（typeIIIsecretionsystem，T3SS）分泌的多種毒力蛋白，即效應(yīng)蛋白是其主要的致病因素[4]。近年來，學(xué)者發(fā)現(xiàn)衣原體T3SS的效應(yīng)蛋白之一—Tarp蛋白，該蛋白在衣原體EB黏附宿主細(xì)胞時(shí)能誘導(dǎo)EB進(jìn)入細(xì)胞[5]，故認(rèn)為該蛋白可能作為衣原體的受體參與EB的黏附入侵。同時(shí)用該蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其能刺激小鼠產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體和細(xì)胞免疫，而且能顯著降低Ct引起小鼠生殖道感染的炎癥程度[6]，故該蛋白可作為預(yù)防和治療Ct感染的候選疫苗之一。但由于該蛋白分子質(zhì)量較大（約100kDa），表達(dá)制備并保持蛋白的天然構(gòu)象較為困難，故選擇其表位作為研究對(duì)象。表位是抗原分子中可與T細(xì)胞和B細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫和體液免疫，從而產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的一段氨基酸序列。

本研究擬以生殖道感染最常見的E型Ct的Tarp蛋白為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)綜合分析預(yù)測Tarp蛋白的B細(xì)胞表位，將預(yù)測獲得的B細(xì)胞表位多肽經(jīng)人工合成后免疫小鼠，進(jìn)一步檢測其刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力及抗體與天然Tarp蛋白的結(jié)合能力。具有免疫原性和抗原性的B細(xì)胞表位的篩選和鑒定，為進(jìn)一步研究Tarp蛋白的生物學(xué)特性及表位疫苗研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑CtE血清Ct標(biāo)準(zhǔn)菌株購自美國典型物保藏中心（ATCC：VR-348B）；HeLa229細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；RPMI-1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司；胎牛血清（FCS）購自杭州四季青公司；HRP-羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、FITC-羊抗鼠IgG抗體和FITC-羊抗兔IgG抗體均購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司；兔抗Ct血清多抗為本室制備[7]；碘化丙碇（PI）購自Solarbio公司；IP細(xì)胞裂解液和ProteinGAgarose購自碧云天生物技術(shù)研究所；表位多肽合成委托上海波泰生物科技有限公司。

1.2 E血清型CtTarp蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測根據(jù)瑞士生物信息研究所提供的SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫得到E血清型CtTarp蛋白氨基酸序列。根據(jù)文獻(xiàn)[8]提供的方法，即應(yīng)用EXPASY服務(wù)器（http://www.expasy.ch/tools）上的GOR預(yù)測Tarp的二級(jí)結(jié)構(gòu)；采用Hopp-Woods親水性參數(shù)、Janin可及性參數(shù)、柔韌性參數(shù)預(yù)測（http://expasy.org/cgibin/protscale.p1）、Emini表面可能性，并按Jameson-Wolf方案預(yù)測蛋白的抗原性。將上述方法互相參照，綜合分析比較，兼顧各項(xiàng)預(yù)測參數(shù)推斷CtTarp蛋白B細(xì)胞識(shí)別的潛在位點(diǎn)。

1.3 BALB/c小鼠免疫采用氨基酸合成法合成篩選表位肽段，純度為85%，用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋為4mg/mL。將6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為8組，每組3只。首先將各表位肽與KLH經(jīng)戊二醛偶聯(lián)，取含100μg表位合成肽的偶聯(lián)物與完全弗氏佐劑等體積充分乳化后，采用背部皮下多點(diǎn)注射途徑免疫小鼠，同時(shí)設(shè)置PBS對(duì)照組。隔周進(jìn)行，共免疫3次，2次的加強(qiáng)免疫多肽與不完全弗氏佐劑充分乳化。分別于第2、第4、第6周收集血清，分裝后置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫小鼠血清抗體IgG及其亞類的檢測以20μg/mL的B細(xì)胞表位合成肽包被96孔酶標(biāo)板，3%牛血清白蛋白（BSA）-PBST封閉，加入稀釋的免疫小鼠血清樣品，37℃反應(yīng)1h，PBST洗滌后，分別加入1:2000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a100μL，37℃反應(yīng)1h，洗滌后經(jīng)四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色，加入2mol/LH2SO4終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果置BioElx800酶標(biāo)儀于450nm波長處讀取A值。每份血清標(biāo)本均重復(fù)3孔檢測。

1.5 陰道分泌物sIgA抗體的檢測用無菌PBS緩沖液取小鼠陰道分泌物，每只小鼠采集200μL樣品，置-80℃保存?zhèn)溆?。ELISA法檢測陰道分泌物sIgA抗體步驟同上，不同的是，二抗為HRP-羊抗鼠sIgA。

1.6 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)及Westernblot法檢測血清抗體與Tarp蛋白的結(jié)合能力E血清型Ct感染HeLa229細(xì)胞48h后，裂解液充分裂解HeLa229細(xì)胞，提取蛋白，與合成肽免疫血清4℃孵育過夜，再與ProteinGAgarose4℃孵育3h，2500r/min離心5min后，棄上清，獲取沉淀物，用預(yù)冷PBS洗滌沉淀，2500r/min離心5min，獲取洗滌后沉淀物。以SDS-PAGE分離沉淀后，轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉后與合成肽免疫血清孵育2h，洗滌后與HRP-羊抗鼠IgG作用1h，TBST漂洗3次，ECL顯影，壓片。同時(shí)用未感染Ct的HeLa229細(xì)胞作為陰性對(duì)照進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和Westernblot法檢測。

1.7 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測血清抗體與天然Tarp抗原的結(jié)合能力E血清型Ct感染HeLa229細(xì)胞48h后，2%多聚甲醛固定10min，用含0.3%TritonX-100的PBS透膜10min，洗滌后采用10%FCS-RPMI-1640室溫封閉1h，加入稀釋的合成肽免疫血清，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照（兔抗Ct血清多抗）及陰性對(duì)照鼠抗PBS、鼠抗KLH血清抗體，與感染的細(xì)胞37℃孵育1h，PBS洗滌后，分別加入含F(xiàn)ITC-羊抗鼠IgG、PI的二抗混合液和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG、PI的二抗混合液，37℃孵育1h，封片后采用激光共聚焦顯微鏡（LeicaTCSSP2）觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間均數(shù)比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tarp蛋白B細(xì)胞表位的預(yù)測蛋白共有957個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約為100kDa。通過生物信息學(xué)技術(shù)，預(yù)測Tarp蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性（見圖1A）、柔韌性（見圖1B）、極性（見圖1C）、表面可能性（見圖1D）、抗原性（見圖1E）等結(jié)果，兼顧各預(yù)測參數(shù)綜合分析比較，推斷CtTarp蛋白B細(xì)胞表位，共得到6個(gè)潛在的B細(xì)胞表位，其氨基酸序列分別為：（F1）aa80-95（TSSSSTQATATSNKTS）；（F2）aa107-123（TSESSETSSTSSSDHIP）；（F3）aa152-170（SNYDDAAADYEPIRTTENI）；（F4）aa171-186（YESIGGSRTSGPENTS）；（F5）aa239-253（VAAAALNSLRGSSY）和（F6）aa497-513（NTTNTTPTTQSTDASTD）。

圖1 Tarp蛋白的各預(yù)測參數(shù)

2.2 血清特異性IgG抗體及其亞類產(chǎn)生情況合成肽包被聚乙烯微量反應(yīng)板后采用ELISA法檢測，結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，F(xiàn)3和F4合成肽組血清特異性IgG抗體水平呈明顯上升趨勢。免疫后第4周，F(xiàn)3合成肽組血清（0.396±0.036）和F4合成肽組血清（0.267±0.04）特異性IgG抗體水平與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.928，P＜0.05），同時(shí)，免疫后第6周，F(xiàn)3和F4合成肽組血清特異性IgG抗體水平與其他組比較，均值分別為0.572±0.040、0.619±0.053，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=46.656，P＜0.05），見圖2A；而F3組和F4組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。末次免疫后2周檢測小鼠血清中IgG亞類水平，F(xiàn)3和F4合成肽組血清特異性IgG1抗體與其他組比較，均值分別為0.351±0.059、0.244±0.032，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.427，P＜0.05），并且F3和F4兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.103，P＜0.05），見圖2B；同時(shí)檢測IgG2a亞類的產(chǎn)生水平，各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)比IgG2a和IgG1抗體水平，F(xiàn)3和F4組多肽誘導(dǎo)的抗體以IgG1類型為主，即其誘導(dǎo)的免疫類型傾向于Th2型。

圖2 不同免疫組小鼠血清特異性抗體IgG及其亞類IgG1和IgG2a的產(chǎn)生情況

2.3 陰道分泌物特異性sIgA抗體產(chǎn)生情況合成肽包被聚乙烯微量反應(yīng)板后采用ELISA法檢測，結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)的增加，F(xiàn)4合成肽組小鼠陰道分泌物中特異性sIgA抗體水平呈明顯上升趨勢。免疫后第6周，F(xiàn)4組小鼠陰道分泌物中特異性sIgA抗體水平為0.503±0.048，與其余組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.213，P＜0.05），見圖3。由于F4組多肽既能刺激機(jī)體產(chǎn)生血清抗體IgG和陰道分泌物抗體sIgA，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要檢測F4組多肽誘導(dǎo)的免疫血清。

2.4 Westernblot法檢測血清抗體與Tarp蛋白的結(jié)合能力Ct感染HeLa229細(xì)胞48h后，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取蛋白，與F4多肽末次免疫后免疫小鼠血清抗體及ProteinGAgarose共沉淀，沉淀物經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)PVDF膜進(jìn)行Westrenblot法分析，結(jié)果（見圖4）顯示，F(xiàn)4多肽免疫組血清沉淀后除了分別在55kDa和22kDa處出現(xiàn)IgG的重鏈和輕鏈，且在相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）大小為105kDa處出現(xiàn)了一條明顯的條帶，與預(yù)期Tarp蛋白大小相符。而陰性對(duì)照（未感染Ct的HeLa229細(xì)胞）小鼠血清沉淀后只在相應(yīng)位置出現(xiàn)IgG的重鏈和輕鏈。結(jié)果提示，F(xiàn)4組免疫血清抗體可與天然Tarp蛋白結(jié)合。

圖3 不同免疫組小鼠陰道分泌物中特異性抗體sIgA的產(chǎn)生情況

圖4 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)及Westernblot法檢測多肽免疫血清與Tarp蛋白的結(jié)合

2.5 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測血清抗體與Tarp蛋白的結(jié)合以抗F4多肽免疫血清為一抗，經(jīng)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測其與天然Tarp蛋白的結(jié)合能力。結(jié)果（見圖5）顯示，細(xì)胞核經(jīng)PI免疫熒光染色后呈紅色熒光，F(xiàn)4血清抗體組細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)綠色熒光，同時(shí)陽性對(duì)照組（Ct免疫兔血清）細(xì)胞質(zhì)中也有綠色熒光呈現(xiàn)，而陰性對(duì)照組（PBS、KLH免疫組血清）均無綠色熒光顯示。結(jié)果提示F4組免疫血清抗體可與天然Tarp蛋白高效結(jié)合。

3 討論

圖5 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測表位免疫血清與Tarp蛋白的結(jié)合（×400）

目前，Ct致病機(jī)制仍不清楚。雖有大量關(guān)于衣原體的疫苗研究，但至今尚無成熟疫苗問世。近年來研究發(fā)現(xiàn)，T3SS的效應(yīng)蛋白之一Tarp蛋白，已成為Ct感染后疾病免疫預(yù)防研究的新靶點(diǎn)[9]。Tarp蛋白預(yù)存于T3SS的注射裝置，該蛋白在衣原體EB黏附宿主細(xì)胞時(shí)能快速磷酸化，并誘導(dǎo)EB進(jìn)入細(xì)胞，故認(rèn)為該蛋白在衣原體感染宿主細(xì)胞的第一步─黏附過程中起到重要作用。同時(shí)Tarp蛋白有較強(qiáng)的免疫原性，有學(xué)者用該蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)其能刺激小鼠產(chǎn)生較高滴度的特異性抗體和細(xì)胞免疫，而且能顯著降低Ct引起小鼠生殖道感染的炎癥程度[6]。故該蛋白可作為預(yù)防和治療Ct感染的候選疫苗之一。

考慮到Tarp蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較大（約100kDa），表達(dá)制備并保持該蛋白的天然構(gòu)象較為困難，故選擇其表位作為研究對(duì)象。表位能誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，同時(shí)可避免與特異性免疫無關(guān)成分導(dǎo)致的病理免疫應(yīng)答，可誘導(dǎo)更強(qiáng)、更特異的免疫效應(yīng)，是目前感染性疾病和惡性腫瘤疫苗的研究熱點(diǎn)[10-11]，因而CtTarp蛋白的表位研究引起了研究人員的重視。

Ct有19個(gè)血清型別，其中D、E、F、G和H等血清型主要引起泌尿生殖道感染，而其中E型則是國內(nèi)外報(bào)道[12-13]中最為常見的型別。因此，本研究以E血清型CtTarp蛋白為基礎(chǔ)，通過生物信息學(xué)技術(shù)分析，初步預(yù)測得到該蛋白的6個(gè)潛在的B細(xì)胞表位。Ct主要通過黏膜接觸途徑傳播，血清中的特異性抗體IgG和陰道分泌物中抗體sIgA在保護(hù)生殖道Ct感染中起到非常重要的作用[14]。筆者將初步得到的6個(gè)潛在B細(xì)胞表位多肽經(jīng)人工合成后免疫BALB/c小鼠，其中F3、F4多肽免疫組可在血清中檢測到較高水平的特異性抗體IgG，并以IgG1亞類為主，表明免疫應(yīng)答主要趨于Th2型，進(jìn)一步說明這兩段氨基酸為Tarp蛋白的B細(xì)胞免疫優(yōu)勢區(qū)。同時(shí)，F(xiàn)4多肽免疫組可在陰道分泌物中檢測到顯著高水平的特異性抗體sIgA，而F3多肽免疫組僅檢測到較低水平特異性sIgA抗體，其原因可能與抗原的特性、機(jī)體對(duì)免疫原的敏感性[15]以及與免疫的途徑[16-17]相關(guān)，因此筆者的后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要檢測F4組多肽誘導(dǎo)的免疫血清。

為進(jìn)一步鑒定預(yù)測所得B細(xì)胞表位的抗原性，筆者通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)、Westernblot法和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)等方法檢測了F4多肽免疫組血清與天然Tarp抗原的結(jié)合能力。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和Westernblot法檢測結(jié)果顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約105kDa處檢測到一條帶，說明F4多肽免疫組血清可與感染了Ct的HeLa229細(xì)胞結(jié)合（表達(dá)天然Tarp蛋白），從而證實(shí)預(yù)測所得F4表位具有較強(qiáng)的抗原性。同時(shí)，Westernblot法檢測結(jié)果中，在IgG輕鏈的上方可看到兩條非特異性條帶，說明該蛋白也可與F4多肽免疫血清結(jié)合，考慮為大分子量目的蛋白Tarp的降解產(chǎn)物。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示F4多肽免疫組血清可與感染了Ct的HeLa229細(xì)胞結(jié)合（表達(dá)天然Tarp蛋白），從而進(jìn)一步證實(shí)預(yù)測所得F4表位具有較強(qiáng)的抗原性。

本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)分析初步預(yù)測并鑒定出Tarp蛋白的一個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢表位（aa171-186），其可誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生血清中特異性以IgG1為主的體液免疫，且免疫血清可與天然Tarp蛋白結(jié)合，具有較強(qiáng)的免疫原性和抗原性。其免疫小鼠血清抗體的中和活性及對(duì)Ct動(dòng)物感染模型的免疫保護(hù)作用研究正在進(jìn)行中。