鄭磊，張明，梁天琳，茹翱，劉敏，趙應(yīng)征，田新橋

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 超聲影像科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江溫州 325035）

糖尿病（diabetes milletus，DM）的發(fā)病率近年來在全球范圍內(nèi)迅速上升，嚴重威脅人類的生命健康。糖尿病性心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是DM的一種嚴重并發(fā)癥，也是造成患者死亡的重要原因[1-2]。微血管病變是DCM發(fā)生發(fā)展的重要因素之一，可導致心肌微循環(huán)異常。本研究應(yīng)用實時心肌超聲造影（real-time myocardial contrast echocardiography，RT-MCE）技術(shù)對DM早期大鼠心肌血流灌注進行定量評價，旨在探討該技術(shù)檢測DM早期大鼠心肌微循環(huán)異常的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：健康雄性SD大鼠，24只，鼠齡42～49 d，體質(zhì)量180～220 g，平均（200±12）g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.1.2 儀器：超聲診斷系統(tǒng)（Acuson Sequoia 512C，西門子，德國）；血糖測定儀（羅氏活力型，德國）；光學顯微鏡（奧林巴斯DP72，日本）。

1.1.3 試劑：SonoVue超聲造影劑（意大利Bracco公司生產(chǎn)，由上海博萊科信誼藥業(yè)有限責任公司包裝）；10%甲醛溶液（上海生工生物工程有限公司）；水合氯醛（加拿大Bio Basic有限公司生產(chǎn)，由上海生工生物工程有限公司分裝）；鏈脲佐菌素粉劑（加拿大Bio Basic有限公司生產(chǎn)，由上海生工生物工程有限公司分裝）；兔抗鼠CD31抗體/血小板內(nèi)皮細胞黏附分子-1（加拿大Bio Basic有限公司生產(chǎn)，由上海生工生物工程有限公司分裝）；即用型免疫組織化學試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；血糖試紙（德國羅氏活力型血糖儀專用試紙）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組：24只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成DM組與對照組，每組12只。

1.2.2 動物模型制備及判定標準：DM組大鼠腹腔注射1%鏈脲佐菌素溶液，注射劑量為70 mg/kg體質(zhì)量（注射前用0.1 mol/L，pH 4.0～4.4的枸櫞酸緩沖液配制），于注射后第3天和第7天取尾靜脈血測定血糖濃度，血糖值大于16.7 mmol/L，且具有多食、多飲、多尿及體質(zhì)量減輕癥狀者選為DM模型。對照組大鼠腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。通風恒溫鼠籠飼養(yǎng)，消毒鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，常規(guī)飼養(yǎng)8周。

1.2.3 造影劑的配制：將5 mL 0.9%氯化鈉溶液加入SonoVue瓶中（瓶內(nèi)含59 mg六氟化硫氣體和25 mg凍干粉）即形成微泡混懸液，90%微泡直徑小于6μm，平均直徑約2.5μm，注射前振蕩搖勻，并在實驗過程中持續(xù)搖勻。

1.2.4 檢查方法：實驗大鼠10%水合氯醛臀肌注射麻醉，劑量為2 mL/kg。待充分麻醉后，心前區(qū)剃毛。采用Sequoia 512C彩色多普勒診斷系統(tǒng)，內(nèi)置RT-MCE造影模式，探頭頻率設(shè)置為12～14 MHz（15L8-w線陣探頭），將探頭放置于大鼠心前區(qū)，探頭與皮膚之間用耦合劑填充。按Cadence鍵進入造影模式，圖像深度3～4 cm，按RES鍵局部放大感興趣區(qū)域，將焦點聚集于遠場，機械指數(shù)0.35，造影脈沖序列調(diào)制，調(diào)整增益至心肌組織內(nèi)無明顯聲學信號，并在整個過程中保持恒定。造影劑輸注方式為經(jīng)尾靜脈緩慢注射。在靜息狀態(tài)下行乳頭肌水平左室短軸心肌造影，觀察心腔及心肌內(nèi)的造影劑充填，待心肌內(nèi)造影劑充填充分后，用高能量脈沖（機械指數(shù)=1.6）破壞心肌內(nèi)的造影劑，隨后儀器自動轉(zhuǎn)為低能量顯像（機械指數(shù)=0.1），獲得造影實時動態(tài)圖像。所有實時動態(tài)圖像存儲在MO光盤，后導入Siemens Sygno US Workplace3.01分析軟件脫機ACQ分析。

1.2.5 圖像分析：在Siemens Sygno US Workplace3.01分析軟件中，取第一幀左室短軸切面的前壁心肌組織勾畫出感興趣區(qū)域（避開心內(nèi)膜、心外膜及乳頭肌等干擾因素），軟件自動對每一幀圖像中感興趣區(qū)域進行追蹤，并允許操作者可以在任何一幀調(diào)整感興趣區(qū)域的位置，使其始終位于相應(yīng)的心肌組織內(nèi)。分析軟件對每一幀圖像感興趣區(qū)域的平均聲學強度進行測量后，擬合成聲學強度-時間曲線y=A×（1-e-βt），其中A為感興趣區(qū)域的峰值聲學強度，反映局部心肌的血容量，即微血管密度，β為造影劑灌注速度，反映心肌的血流速度，二者的乘積A×β代表局部心肌血流量，每只大鼠分析2～3次取平均值來減小誤差。分析曲線的GOF系數(shù)小于0.9者均被剔除。

1.2.6 心肌組織CD31免疫組織化學染色：超聲檢查結(jié)束后，處死大鼠，取出心臟，取乳頭肌水平左室心肌組織，用10%甲醛固定，石蠟包埋后切片。采用polymer法對心肌組織石蠟切片進行CD31免疫組織化學染色，光學顯微鏡下觀察。每組取12張切片，每張切片隨機選取20個高倍鏡視野（×400），計算其中的微血管斷面的數(shù)量，取平均值，作為心肌組織中的微血管密度（MVD）（個/高倍視野）。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量指標均采用±s表示，兩組計量資料進行正態(tài)性檢驗與方差齊性檢驗，如資料符合正態(tài)分布且方差齊，均數(shù)比較采用成組樣本t檢驗，如資料不符合正態(tài)分布或方差不齊，均數(shù)比較采用成組樣本t’檢驗。DM組的A及MVD采用Peason相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 DM大鼠造模成功8周后，DM組死亡1只，另有1只因血糖濃度未達標而被剔除，對照組無死亡。因此，8周后進行超聲檢查時，兩組數(shù)量分別為：DM組10只，對照組12只。

2.2 MCE各指標的比較 本實驗中所有大鼠感興趣區(qū)域均獲得滿意的MCE圖像，并成功擬合出聲學強度-時間曲線（見圖1），擬合度為0.93～0.99。在靜息狀態(tài)下，兩組大鼠前壁心肌組織MCE的各項指標中，DM組的A、A×β均較對照組明顯減低（P＜0.01）；β較對照組減低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 DM組及對照組MCE圖像，可見DM組心肌血流灌注較對照組明顯減低

表1 DM組和對照組MCE各參數(shù)及MVD值的比較（±s）

表1 DM組和對照組MCE各參數(shù)及MVD值的比較（±s）

注：dB：分貝；HP：高倍視野。與對照組比： aP＜0.01

組別 n A（dB） β（s-1） A×β（dB/s） MVD（/HP）DM組 10 18.56±2.02a 0.71±0.06 13.40±2.37a 13.30±1.89a對照組 12 24.13±2.52a 0.76±0.08 18.49±3.21a 26.08±2.51a

2.3 CD31免疫組織化學染色結(jié)果 CD31免疫組織化學染色結(jié)果顯示毛細血管內(nèi)皮細胞呈棕褐色（見圖2），顯微鏡下MVD顯示DM組MVD與對照組相比明顯減低（P＜0.01）（見表1）。

圖2 DM組及對照組心肌CD31免疫組織化學染色（×400）

2.4 相關(guān)性分析 DM組A與MVD呈線性正相關(guān)（r=0.903，P＜0.01）（見圖3）。

3 討論

RT-MCE技術(shù)是近年來發(fā)展起來的超聲新技術(shù)，也是目前評價心肌血流灌注最為簡便、準確且安全的方法，其原理是指將含有微氣泡的造影劑通過外周靜脈注入體內(nèi)，由于目前應(yīng)用的微泡大小與紅細胞相當，血流動力學與紅細胞相似，可自由通過心臟毛細血管而分布于心肌組織內(nèi)，微泡在血液內(nèi)產(chǎn)生大量的液-氣界面，從而反射大量超聲波信號，使心肌微循環(huán)的視頻密度增加，利用超聲技術(shù)觀察心肌的對比增強，就可以在微血管水平評價組織血流灌注信息。應(yīng)用高能量的超聲脈沖破壞心肌內(nèi)的超聲造影劑，隨后轉(zhuǎn)為低能量模式，可以實時顯示造影劑在心肌內(nèi)隨血流再灌注的過程，實現(xiàn)了心肌微循環(huán)的動態(tài)顯示[3]。此外，與單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)（single-photon emission computed tomography，SPECT）和正電子發(fā)射斷層成像術(shù)（positron emission tomography，PET）等技術(shù)相比，RTMCE還具有無創(chuàng)、重復(fù)性好及價格實惠等優(yōu)點，因此，RT-MCE已逐步應(yīng)用于定量評價心肌血流灌注的實驗和臨床研究之中[4-5]。然而，迄今應(yīng)用RT-MCE技術(shù)評價DM早期心肌血流灌注的研究較少。

圖3 DM組A與MVD散點圖

本研究應(yīng)用RT-MCE對DM早期大鼠心肌血流灌注進行定量分析，發(fā)現(xiàn)DM大鼠成模后8周時反映心肌血流灌注的指標A及A×β均較對照組明顯減低，同期免疫組織化學染色顯示DM早期大鼠心肌MVD與對照組相比明顯減低。有學者[6]應(yīng)用RT-MCE技術(shù)在開胸條件下檢測DM早期大鼠心肌血流灌注情況，結(jié)果證實在靜息狀態(tài)下DM組心肌血容量和血流量較正常組明顯減低。類似的研究結(jié)果在臨床研究中也得到證實，李薇玢等[7]應(yīng)用RT-MCE觀察了早期2型DM患者心肌血流灌注情況，結(jié)果表明靜息狀態(tài)下2型DM患者心肌血流灌注較對照組明顯減低。以上研究表明DM早期大鼠心肌微循環(huán)已經(jīng)受到損傷。分析其原因，DM早期上述心肌血流灌注變化主要與高血糖引起的心肌微血管病變有關(guān)。已有的研究證實，微血管病變作為DCM心肌損害的特征性病變之一，主要表現(xiàn)為心肌微血管基底膜增厚、管腔橫截面積減小、微血管密度減低等，這些改變可導致微循環(huán)障礙、心肌細胞缺血損傷和壞死。在本研究中，DM組β雖較對照組降低，但差異無統(tǒng)計學意義，可能與DM大鼠病程較短及樣本量較少等有關(guān)。此外，通過對DM組的A與MVD進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，因此，造影指標A能較為準確反映MVD的變化，是評價心肌血流灌注的敏感指標。

綜上所述，DM早期即可出現(xiàn)心肌血流灌注異常，RT-MCE技術(shù)可敏感地檢測出這種微循環(huán)異常改變，具有重要的應(yīng)用價值。然而，本研究尚存在一定的局限性，比如：本研究采用經(jīng)胸RT-MCE無創(chuàng)評價心肌血流灌注雖具有一定優(yōu)勢，但因聲像圖受到胸廓和肺組織的干擾，部分室壁顯示不理想因而無法評估；另外，本研究未行負荷心肌超聲造影，未能評價DM大鼠早期血流灌注儲備的變化，有待于今后進一步實驗研究。

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