劉金華，劉 韜，孟日增，聶丹丹，王瑋琳，王浩天

（1.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林 長春130062；2.吉林大學藥學院，吉林 長春130021）

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogens，LM）是一種重要的食源性致病菌，他能引起人類和動物李斯特氏菌病。人和動物感染LM可引起單核細胞增多癥、腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)，嚴重威脅人類健康和社會經(jīng)濟的發(fā)展［1，2］。該菌可通過眼睛及破損皮膚、粘膜進入體內(nèi)而造成感染，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，也是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在衛(wèi)生微生物檢驗中是一種重要的檢測目標［3］。目前LM常用的檢測方法一般以生化培養(yǎng)鑒定、血清學檢測等為主［4］。光纖生物傳感器是激光技術(shù)和現(xiàn)代低消耗的光纖技術(shù)共同發(fā)展的產(chǎn)物，是目前應用較為廣泛的生物傳感器之一［5，6］。本研究基于光纖倏逝波生物傳感器技術(shù)建立一種快速、高效檢測單核細胞增生李斯特氏菌的方法，該方法為LM的衛(wèi)生檢驗提供一種新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，ATCC13124）、綿羊李斯特氏菌（listeria ivanovii，ATCC19119）、英諾克李斯特氏菌（listeria innocua，ATCC19119）、金 黃 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus，ATCC25923）、腸炎沙門氏菌（salmonella enteritidis，ATCC13076）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium，ATCC13311）、大 腸 埃 希 菌（Escherichia coli，ATCC25922）、蠟 樣 芽 胞 桿 菌（Bacillus cereus，ATCC11778））、單核細胞增生李斯 特 氏 菌 （Listeria monocytogens，LM，ATCC19111）、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，ATCC33291）等均為本實驗室保存菌種。

1.2 主要儀器與試劑

光纖生物傳感器，聚苯乙烯光纖均由中國科學院長春光學精密機械研究所提供。LM多克隆抗體、LM單克隆抗體、納米量子點CdFe標記的抗LM的多克隆抗體均由本實驗室制備，磷酸鹽緩沖液PBS購自北京索萊寶科技有限公司，牛津瓊脂OXA、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯（TSB－YE）等LM培養(yǎng)基均購自北京蘭伯瑞技術(shù)有限責任公司，1－乙基－3－（3－二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽 （EDC）購于北京晶美有限公司。

1.3 CdTe量子點與LM多克隆抗體的偶聯(lián)

取1ml的水溶性CdTe量子點與1ml PBS（pH＝7.4）緩沖液混合，將400μl的LM多克隆抗體（1mg／ml）加入到上述混合液中，然后將100μl新制備的EDC溶液（4mg／ml）加入到混合液中，樣品在37℃培養(yǎng)箱中避光反應2個小時，然后4℃過夜。將2.5ml反應混合液（包含1.0ml量子點，1.0ml PBS，400μl抗體，100μl EDC）5 000r／min離心2min，取上清液，上清用截留分子量為100000的超濾膜反復進行超濾，去除小分子物質(zhì)和未反應的CdTe量子點，收集超濾膜截留的CdTe－抗體偶聯(lián)物，然后用PBS（pH7.4）溶解，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 光纖的包被

按Sai V V等人方法［7］，對光纖進行LM抗體包被，將光纖表面先用清洗液（濃HCl：乙醇體積比為1∶1）清洗10min，再用濃硫酸清洗10min，接下來在超純水中煮沸10min，使光纖表面具有親水的極化層。然后將處理好的光纖放入15μg／ml LM單抗的溶液中浸泡2h，取出用去離子水洗凈，即制成用于檢測單核細胞增生李斯特氏菌光纖探針。

1.5 檢測靈敏度的確定

將LM菌株在TSB－YE液體培養(yǎng)基中42℃培養(yǎng)18h－24h。瓊脂平板進行計數(shù)。將包被LM的單克隆抗體的光纖分別插入濃度為3×100CFU／ml、3×101CFU／ml、3×102CFU／ml、3×103CFU／ml、3×104CFU／ml、3×105CFU／ml和3×106CFU／ml的LM菌溶液中孵育10min，加陰性對照，PBS清洗3遍后再與100μg／ml標記量子點的多抗反應10min，用去離子水洗凈上機測量結(jié)果。

1.6 特異性試驗

用建立的方法對上述產(chǎn)氣莢膜梭菌、綿羊李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌、蠟樣芽胞桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲桿菌進行特異性交叉試驗，同時設空白對照。

1.7 人工添加樣品的檢測

取雞肉25g加入225ml的TSB－YE液體培養(yǎng)基中，分別加入單核細胞增生李斯特菌懸液，使其濃度分別達到5CFU／ml，10CFU／ml，20CFU／ml，30CFU／ml，40CFU／ml，50CFU／ml。均質(zhì)后取2 ml上清，煮沸滅菌，各取1ml用于檢測。每組試驗重復3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 靈敏度實驗結(jié)果

將純培養(yǎng)的菌液用PBS緩沖液稀釋成3×100－3×106CFU／ml的濃度梯度，當LM菌體濃度為3×101－3×106CFU／ml時，可檢測到明顯的陽性信號；當菌液濃度小于3×101CFU／ml時結(jié)果為陰性。故該方法對LM檢測的靈敏度可達到3×101CFU／ml，見圖1。

圖1 單核細胞增生李斯特氏菌靈敏度的檢驗

2.2 特異性實驗結(jié)果

用建立的光纖倐逝波生物傳感器分別對105CFU／ml不同菌株的菌液檢測，顯示該方法對于單核細胞增生李斯特氏菌具有較好的特異性，可以得到較明顯信號。其他菌株的檢測結(jié)果均為陰性，結(jié)果見圖2。

圖2 單核細胞增生李斯特氏菌特異性的檢驗

2.3 人工添加樣品的檢測

將標準LM稀釋到一定濃度加入雞肉中，檢測結(jié)果如表1所示，其檢測靈敏度可達到30CFU／ml，即在樣品中若含有30CFU／ml的在單核細胞增生李斯特氏菌即可被檢出，而對于20CFU／mL的濃度的樣品3次檢測中可能有1－2次結(jié)果為陽性。

表1 人工感染樣品檢測結(jié)果

3 討論

光纖倏逝波生物傳感器是以光纖和光電轉(zhuǎn)換器件為主要轉(zhuǎn)換元件的一種光電轉(zhuǎn)換設備［8］，他主要是利用倏逝波場來激發(fā)光纖表面標記在生物分子上的熒光染料，從而檢測通過特異性反應附著于纖芯表面倏逝波場范圍內(nèi)的生物分子［9，10］。由于倏逝波是光在光纖中以全反射傳播時產(chǎn)生的部分穿透界面的光波，他只存在于界面附近薄層內(nèi)，只對來自光纖界面附近極薄的一層熒光分子進行熒光激發(fā)和收集，而樣品中游離的熒光分子則幾乎不會被激發(fā)和收集，這樣便省去了傳統(tǒng)生化檢測方法中繁冗復雜的清洗步驟，簡化了操作步驟，將檢測時間從常規(guī)分析的幾個小時縮短到十幾分鐘，大大縮短了檢測時間提高了檢測效率［11，12］。

當光纖倏逝波生物傳感器檢測目標菌時，光纖表面固定的生物識別分子抗體與目標菌發(fā)生特異性反應，進而與熒光染料標記的檢測抗體結(jié)合，使熒光染料固定于光纖表面，倏逝波激發(fā)出熒光，其中部分熒光進入光纖，通過信號轉(zhuǎn)換器將光信號轉(zhuǎn)換為物理信號，之后經(jīng)過放大處理，獲得數(shù)據(jù)。通過檢測是否激發(fā)出熒光信號及熒光信號的強度大小來分析待測物的有無及含量。與其他生物檢測手段相比，光纖生物傳感器具有如下優(yōu)點：首先該方法不受光纖表面倏逝波場以外的生物分子的干擾具有較高的檢測靈敏度；其次該技術(shù)操作簡單，測量用時較短可應用于現(xiàn)場檢測［9］。在本研究試驗中，用納米量子點做熒光標記物，相對于傳統(tǒng)的有機熒光染料來說，納米量子點具有更高的靈敏性和穩(wěn)定性。使用納米量子點代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光染料檢測病原微生物，能夠獲得了更強的熒光強度，更長的發(fā)光時間以及能夠?qū)晒庑盘柛_的檢出，從而使得大大的提高了檢測的靈敏度。本實驗中，完成一次檢測過程只需30 min，而且該檢測方法具有較高的靈敏度和較好的特異性，使得該技術(shù)具有較好的應用前景。

［1］段 霞.單核細胞增生李斯特氏菌膠體金免疫層析方法的建立［D］.南昌大學，2011.

［2］梁雄燕，顧玉芳，楊玉瑩，等.雞單核細胞增生性李斯特菌病診斷與病原鑒定［J］.中國家禽，2014，36（1）：59.

［3］趙 靜，孫海娟，馮敘橋，等.食品中食源性致病菌污染狀況及其監(jiān)測技術(shù)研究進展［J］.食品安全質(zhì)量檢測學報，2013，4（5）：1353.

［4］羅雁非，賈芙蓉，丁 旭，等.膠體金標記單克隆抗體測定單增李斯特菌試劑盒制備［J］。中國實驗診斷學，2009，17（12）：1231.

［5］畢衛(wèi)紅，郭 璇，王凌霄.免標記光纖生物傳感器的研究進展［J］.燕山大學學報，2013，37（3）：189.

［6］李 博，鄭 磊，王 前，等.電化學DNA生物傳感器設計及在醫(yī)學檢驗中的應用進展［J］.分子診斷與治療雜志，2011，3（1）：46.

［7］Rabbany SY，Donner BL，Ligler FS.Optical immunosensors［J］.Crit Rev Biomed Eng，1994，22（6）：307.

［8］Anderson GP，Rowe－Taitt CA，Ligler FS.Raptor：A Portable，Automated Biosensor［C］.Proceedings of the First Joint Conference on Point Detection for Chemical and Biological Defense，Williamsburg，Virginia，23－27October，2000：138－144.

［9］Carolina Beres，F(xiàn)abio Vieira，Batistade Nazare，et al.Tapered plastic optic fiber－based biosensor－Tests and application［J］.Biosensors and Bioelectronics，2011，30（1）：328.

［10］單 聰，陳西平.光纖倏逝波生物傳感器在微生物檢測中的應用［J］.衛(wèi)生研究，2010，39（2）：254.

［11］黃惠杰，翟俊輝，趙永凱，等.多探頭光纖倏逝波生物傳感器及其性能研究［J］.中國激光，2004，31（6）：718.

［12］徐鎖生，魏 華.光纖倏逝波生物傳感器及其研究進展［J］.生物技術(shù)通訊，2008，19（1）：148.