溫見翔，陳 娟，楊 虹

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518036）

陰溝腸桿菌是臨床常見的條件致病菌之一，亦是醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌［1］。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，陰溝腸桿菌在抗生素的選擇性壓力下出現(xiàn)高耐藥性和多重耐藥。陰溝腸桿菌感染已成為醫(yī)院感染的重要致病菌之一。我院陰溝腸桿菌感染分布與耐藥狀況亦不容樂觀［2］，本研究通過檢測(cè)我院臨床分離的141株陰溝腸桿菌AcrAB－TolC外排系統(tǒng)acrA，acrB，tolC和acrR 4種基因，分析4種基因的攜帶分布，研究AcrAB－TolC外排系統(tǒng)基因與陰溝腸桿菌耐藥性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1菌株鑒定與藥敏試驗(yàn)2010年5月至2013年6月從北京大學(xué)深圳醫(yī)院門急診及住院部患者痰液、尿液、血液、膿液、膽汁等標(biāo)本分離到的陰溝腸桿菌共計(jì)141株。所有菌株經(jīng) MicroScanWalkaway40細(xì)菌分析儀進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，測(cè)其對(duì)各種抗生素的最小抑菌濃度（MIC）。同一患者同一部位分離出的陰溝腸桿菌，如藥敏結(jié)果相同，僅采用首次分離菌株。以大腸桿菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為質(zhì)控菌株，藥敏結(jié)果依據(jù)CLSI2013年執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.2儀器與試劑美國(guó)德靈公司生產(chǎn)的 MicroScanWalkaway40型全自動(dòng)細(xì)菌分析系統(tǒng)及該公司提供的陰性菌復(fù)合板；PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)Biosytems公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)BIO－RAD公司產(chǎn)品質(zhì)；標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA、Taq DNA聚合酶、pMD18－T載體、DNA膠回收試劑盒為TAKARA公司產(chǎn)品。

1.3AcrAB－TolC外排系統(tǒng)基因的擴(kuò)增根據(jù)AcrAB－TolC外排系統(tǒng)acrA，acrB，acrR和tolC 4種基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物，并由TAKARA公司合成引物，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。采用煮沸法提取各株陰溝腸桿菌基因組的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。四種基因的PCR反應(yīng)總體積均為50μl（DNA聚合酶系統(tǒng)Premix Taq9.5μl，上游引物及下游引物各1μl，DNA模板2μl，去離子水36.5μl）?；驍U(kuò)增反應(yīng)條件分別為：acrA基因94℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5min；acrB基因94℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸3min，共40個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5min；acrR基因94℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，48℃退火30 s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5 min；tolC基因94℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，43℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，72℃終末延伸5min。PCR產(chǎn)物在含0.5mg／L溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠中電泳30min，使用BIO－RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，分析PCR產(chǎn)物。

1.4擴(kuò)增產(chǎn)物的純化、克隆與測(cè)序PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收并純化，將其與pMD－18T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌E coli JM109中，用含氨芐西林的LB平板篩選含陽性質(zhì)粒的菌落，陽性菌經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后送TAKARA公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

表1 靶基因引物識(shí)別序列及目的產(chǎn)物長(zhǎng)度

2 結(jié)果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果141株陰溝腸桿菌對(duì)常見抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。根據(jù)耐藥表型不同，將141株陰溝腸桿菌分為4組見表3。

表2 141株陰溝腸桿菌對(duì)常見抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表3 141株陰溝腸桿菌耐藥表型分組

2.2AcrAB－TolC外排系統(tǒng)基因擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果acrA，acrB，acrR和tolC 4種基因在141株陰溝腸桿菌中均擴(kuò)增出陽性株，其PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1、圖2、圖3和圖4。4種基因PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測(cè)序，測(cè)序 結(jié) 果 與 （CNBI）Genbank 數(shù) 據(jù) 庫 （http：／／www.cnbi.nim.nih.gov BLAST 程序）進(jìn)行對(duì)比，同源性比對(duì)后證實(shí)，4種基因與陰溝腸桿菌同源性均為96%。

圖1 acrA基因PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2 acrB基因PCR擴(kuò)增電泳圖

圖3 acrR基因PCR擴(kuò)增電泳圖

圖4 tolC基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果141株陰溝腸桿菌分別擴(kuò)增出139株acrA基因陽性株，陽性率為98.58%；72株acrB基因陽性株，陽性率為51.06%；111株acrR基因陽性株，陽性率為78.72%；116株tolC基因陽性株，陽性率為82.27%，4種基因的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表4。分別比較多重耐藥組、雙重耐藥組、單重耐藥組和敏感組不同基因的陽性率，acrA基因和acrB基因在4組菌株的陽性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而AcrR基因和tolC基因的陽性率組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表5。

表4 4種基因陽性率的比較

表5 四種基因在不同組中陽性率的比較

3 討論

主動(dòng)外排系統(tǒng)是引起細(xì)菌多重耐藥的機(jī)制之一，作為一種非特異性耐藥機(jī)制，可引起細(xì)菌固有的耐藥性［3，4］，而耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化家族 AcrAB－TolC外排系統(tǒng)是導(dǎo)致革蘭陰性菌多重耐藥性的重要因素［5－7］。陰溝腸桿菌染色體上存在acrA，acrB，acrR和tolC基因，可以編碼AcrAB－TolC外排泵，多重耐藥的陰溝腸桿菌存在活躍的AcrAB－To1C外排泵［8］，陰溝腸桿菌多重耐藥與主動(dòng)外排系統(tǒng)有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，141株陰溝腸桿菌高水平攜帶AcrAB－TolC系統(tǒng)的acrA，acrB，acrR和tolC四種基因，其中acrA基因的陽性檢出率最高，acrB基因的陽性檢出率最低，四種基因的陽性檢出率有顯著的差異（P＜0.01）。根據(jù)耐藥表型的不同，將141株陰溝腸桿菌分為多重耐藥組、雙重耐藥組、單重耐藥組和敏感組，比較各組陰溝腸桿菌不同基因的陽性檢出率，acrA基因和acrB基因在不同組的陽性率有顯著性差異（P＜0.01），各耐藥組高于敏感組，且多重耐藥組陽性率最高；acrR基因和tolC基因在不同組的陽性率無顯著性差異。

［1］Yu WL，Cheng HS，Lin HC，et al.Outbreak investigation of nosocomial enterobacter cloacae bacteraemia in a neonatal intensive care unit［J］.Scand J Infect Dis，2000，32（3）：293.

［2］溫見翔，王 德，王 麗.臨床陰溝腸桿菌感染分布及耐藥性分析［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010，10（6）：704.

［3］Schumacher A，Trittler R，Bohnert JA，et al.Intracellular accumulation of linezolid in Escherichia coli，Citrobacter freundii and Enterobacter aerogenes：role of enhanced efflux pump activity and inactivation［J］.J Antimicrob Chemother，2007，59（6）：1261.

［4］Poole K.Efflux－mediated resistance to fluoroquinolones in gramnegative bacteria［J］.Antimicrob Agents Chemother，2000，44（9）：2233.

［5］Zheng J，Cui S，Meng J.Effect of transcriptional activators RamA and SoxS on expression of multidrug efflux pumps AcrAB and AcrEF in fluoroquinolone－resistant Salmonella Typhimurium［J］.J Antimicrob Chemother，2009，63 （1）：95.

［6］Keeney D，Ruzin A，Bradford PA.RamA，a transcriptional regulator，and AcrAB，an RND－type efflux pump，are associated with decreased susceptibility to tigecycline in Enterobacter cloacae［J］.Microb Drug Resist，2007，13（1）：1.

［7］Bratu S，Landman D，George A，et al.Correlation of the expression of acrB and the regulatory genes marA，soxS and ramA with antimicrobial resistance in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae endemic to New York City［J］.J Antimicrob Chemother，2009，64（2）：278.

［8］劉 軍.陰溝腸桿菌耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，2009，30（2）：49.