孫慶國，趙文靜，匡玉吉，李 煒，周翠紅，董麗芳，張寶華

（吉林省肝膽病醫(yī)院，吉林長春130062）

BriCyte E6和FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀在淋巴細(xì)胞亞群分析中的對比研究

孫慶國＊，趙文靜＊，匡玉吉，李 煒，周翠紅，董麗芳，張寶華

（吉林省肝膽病醫(yī)院，吉林長春130062）

流式細(xì)胞術(shù)是在上個(gè)世紀(jì)70年代逐漸發(fā)展起來的一種集光學(xué)、電子、流體力學(xué)、計(jì)算機(jī)、生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科，能夠?qū)?xì)胞的物理和化學(xué)特性進(jìn)行檢測和分析的一種技術(shù)。最初，流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍主要限于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、植物學(xué)等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。不過隨著基礎(chǔ)研究成果不斷向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化，流式細(xì)胞儀也開始從研究領(lǐng)域擴(kuò)展到臨床領(lǐng)域。

臨床上，流式細(xì)胞儀主要應(yīng)用于淋巴細(xì)胞亞群分析。淋巴細(xì)胞大致分為T淋巴細(xì)胞（CD3＋細(xì)胞）、B淋巴細(xì)胞（CD3－CD19＋細(xì)胞）和NK細(xì)胞（CD3－CD16／56＋細(xì)胞）3個(gè)亞群。此外根據(jù)是否表達(dá)CD4和CD8，還可以將T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步劃分為輔助／誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3＋CD4＋細(xì)胞）和抑制／細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3＋CD8＋細(xì)胞）。淋巴細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)對于免疫缺陷病、腫瘤、感染性疾病、自身免疫病等疾病的診斷、治療監(jiān)控、預(yù)后判斷都具有重要意義。

本研究的主要目的是對BriCyte E6和FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀在淋巴細(xì)胞亞群檢測中的一致性進(jìn)行評價(jià)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象 選擇免疫缺陷病、自身免疫病、腫瘤、感染性疾病、器官移植、過敏性疾病等患者及健康體檢者共117例，獲取新鮮抗凝靜脈血樣本。其中男性37例，女性80例，年齡8－84歲，平均年齡50.58±19.39。

1.1.2 材料和方法 按試劑說明書，分別使用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司（邁瑞）的PerCP－CD45／FITC－CD3／APC－CD4／PE－CD8四色試劑（流式細(xì)胞法）、PerCP－CD45／FITC－CD3／APCCD19／PE－CD16＋56四色試劑（流式細(xì)胞法）以及BD公司的淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒對外周靜脈血樣本進(jìn)行處理。處理后的樣本在BriCyte E6和FACSCantoⅡ上分別使用客戶端軟件MRFlow和FACSCantoII Clinical Software進(jìn)行檢測，獲得CD3＋細(xì)胞、CD3＋CD4＋細(xì)胞、CD3＋CD8＋細(xì)胞、CD3－CD19＋細(xì)胞以及CD3－CD16／56＋細(xì)胞的百分比和絕對計(jì)數(shù)。

1.1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對兩臺儀器的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析、線性回歸分析和Bland－Altman分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)R、回歸方程和偏差。統(tǒng)計(jì)分析采用SAS 9.0。

2 結(jié)果

2.1 BriCyte E6和FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞亞群的結(jié)果圖

MRFlow和FACSCanto Clinical Software均能實(shí)現(xiàn)淋巴細(xì)胞亞群自動(dòng)檢測、分析和報(bào)告。由于BriCyte E6可以直接測量樣本體積，因此無需在樣本中額外添加參比的熒光微球，即可獲得樣本中細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)結(jié)果（圖1）。相反，F(xiàn)ACSCantoⅡ由于不能測量樣本體積，因此在測定時(shí)需要在樣本中添加一定量的熒光微球，然后通過間接計(jì)算才能得出絕對計(jì)數(shù)結(jié)果（圖2）。

圖1 BriCyte E6流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果圖

圖2 FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果圖

2.2 淋巴細(xì)胞亞群的百分比

以兩儀器百分比測定結(jié)果做線性回歸顯示，兩儀器結(jié)果間線性方程的斜率在0.9534－1.0247間，截距在－0.2642～0.6914間，判定系數(shù)（R2）均大于0.96（圖3）。以兩儀器測定結(jié)果均值（Average）和差值（Bias）做Bland－Altman分析顯示，儀器測定結(jié)果間的差值均值在－1.3692～1.1488，95%一致性界限也在較窄的范圍內(nèi)（圖4）。

圖3 淋巴細(xì)胞亞群百分比（%）的線性回歸圖

圖4 兩種儀器淋巴細(xì)胞亞群百分比（%）的Bland－Altman圖

2.3 淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)

以兩儀器絕對計(jì)數(shù)測定結(jié)果做線性回歸分析顯示，兩儀器結(jié)果間線性方程的斜率在0.9348－0.9856間，截距在－10.9201～15.9736間，判定系數(shù)（R2）均大于0.96（圖5）。以兩儀器測定結(jié)果均值（Average）和差值（Bias）做Bland－Altman分析顯示，儀器測定結(jié)果間的差值均值在－41.6958～－8.5849，95%一致性界限也在較窄的范圍內(nèi)（圖6）。

圖5 淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)（＃）的線性回歸圖

圖6 兩種儀器淋巴細(xì)胞亞群絕對計(jì)數(shù)（＃）的Bland－Altman圖

3 討論

不同的流式細(xì)胞儀在使用不同的試劑進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群分析時(shí)，可能會(huì)存在較大的偏差，因此臨床上建議實(shí)驗(yàn)室使用同廠配套的試劑系統(tǒng)進(jìn)行樣本處理［1］。為了減少不同試劑系統(tǒng)對于檢測的影響，本研究在對BriCyte E6和FACSCanto II的一致性評價(jià)中也采用了儀器生產(chǎn)商推薦的同廠試劑。從結(jié)果可以看出，兩種儀器的淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果間具有較好的線性關(guān)系，且結(jié)果間的差值也較小，說明兩種儀器在淋巴細(xì)胞亞群分析上具有良好的一致性。

在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)可以分為雙平臺法和單平臺法。雙平臺法從流式細(xì)胞儀上獲得淋巴細(xì)胞亞群的百分比，同時(shí)從血細(xì)胞分析儀獲得淋巴細(xì)胞的絕對值，并通過細(xì)胞絕對值與百分比的乘積得出各類淋巴細(xì)胞亞型的絕對計(jì)數(shù)。單平臺法則不用借助血細(xì)胞分析儀的結(jié)果，僅從流式細(xì)胞儀單一平臺上就可以獲得細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)。單平臺法也包括兩種絕對計(jì)數(shù)測量方式：一種是流式細(xì)胞儀通過直接測量樣本體積，然后以測量細(xì)胞數(shù)除以樣本體積就可直接獲得細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)（如邁瑞、Partec和Merck Millipore的產(chǎn)品）；另一種方式則需要在樣本中添加一定數(shù)量的絕對計(jì)數(shù)參比微球，然后通過復(fù)雜計(jì)算來間接獲得細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)（如BD和Beckman Coulter的產(chǎn)品）。有研究者曾對這兩種方式的CD3＋CD4＋細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)做過比較，結(jié)果表明兩種方式的測定值呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，測定值間的偏差也較?。?－5］。本研究也顯示，基于體積和基于參比微球的兩種單平臺測量方式，不僅在CD3＋CD4＋細(xì)胞檢測上具有較高的相關(guān)系數(shù)和較低的偏差，而且在其他淋巴細(xì)胞亞群的檢測上也體現(xiàn)了良好的一致性。此外，相對于使用參比微球，直接測量體積的單平臺方法測試成本更低，操作也更為簡單，對于改善國內(nèi)基層醫(yī)院以及國際上經(jīng)濟(jì)發(fā)展落后國家和地區(qū)的診療水平也具有重要意義。

［1］黃春梅，郭 野，陳 倩，等.不同流式細(xì)胞分析系統(tǒng)對外周血淋巴細(xì)胞亞群分析結(jié)果的影響［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（5）：403.

［2］Dieye TN，Vereecken C，Diallo AA，et al.Absolute CD4T－cell counting in resource－poor settings：direct volumetric measurements versus bead－based clinical flow cytometry instruments［J］.J Acquir Immune Defic Syndr，2005，39（1）：32.

［3］Pattanapanyasat K，Phuang－Ngern Y，Lerdwana S，et al.Evaluation of a single－platform microcapillary flow cytometer for enumeration of absolute CD4＋T－lymphocyte counts in HIV－1infected Thai patients［J］.Cytometry B Clin Cytom，2007，72（5）：387.

［4］Pattanapanyasat K，Phuang－Ngern Y，Sukapirom K，et al.Comparison of 5flow cytometric immunophenotyping systems for absolute CD4＋T－lymphocyte counts in HIV－1－infected patients living in resource－limited settings［J］.J Acquir Immune Defic Syndr，2008，49（4）：339.

［5］Zijenah LS，Kadzirange G，Madzime S，et al.Affordable flow cytometry for enumeration of absolute CD4＋T－lymphocytes to identify subtype C HIV－1infected adults requiring antiretroviral therapy（ART）and monitoring response to ART in a resourcelimited setting［J］.J Transl Med，2006，45：433.

2013－06－27）

1007－4287（2014）07－1196－04

＊通訊作者