王曉燕 蔡艷霞 田文洪 趙友恒 楊仁池

(1.深圳市第四(福田)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518033； 2.中國醫(yī)學科學院血液病研究所 血液病醫(yī)院，天津 300020)

ITP是一種常見的器官特異性出血性自身免疫性疾病。臨床上以出血和外周血血小板減少、骨髓巨核細胞數(shù)正?；蛟龆喟橛谐墒煺系K為主要表現(xiàn)。目前認為本病是由于患者體內(nèi)產(chǎn)生抗血小板自身抗體與血小板抗原結(jié)合，在單核巨噬細胞系統(tǒng)中與巨噬細胞Fc受體結(jié)合，從而導致血小板迅速從循環(huán)中清除，同時還作用于骨髓巨核系細胞，影響其增殖、分化及成熟[1]。發(fā)病機制尚未完全闡明,但現(xiàn)在公認主要與細胞免疫、體液免疫功能異常有關(guān)[2-5]。

瘦素(Leptin)是肥胖基因(ob gene)編碼，脂肪細胞產(chǎn)生的一種激素樣細胞因子,是由167個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。最近的研究發(fā)現(xiàn)瘦素可以活化CD4+T輔助細胞[6]。瘦素水平下降導致免疫抑制,慢性瘦素缺乏者Thl型細胞功能下降而Th2型細胞功能上升。隨著瘦素含量與自身免疫疾病有密切關(guān)系的報道[7]，研究瘦素在免疫相關(guān)性疾病中的發(fā)病機制倍受學者關(guān)注。瘦素受體(Ob-R) 屬Ⅰ型細胞因子受體家族,人的Ob-R 有長型(Ob-RL) 和短型(Ob-RS)兩種。Matarese[8]發(fā)現(xiàn)在T 細胞、血管內(nèi)皮細胞和CD34+的骨髓造血干細胞上有Ob-RL 表達 。Bennett等于1996年發(fā)現(xiàn)CD34+的造血干細胞表達瘦素受體，同時聯(lián)系骨髓基質(zhì)中的脂肪細胞可分泌瘦素，提出瘦素為造血細胞的發(fā)育提供增殖信號，并且發(fā)現(xiàn)這一增殖信號是由瘦素的長型受體轉(zhuǎn)導的。該項研究提出，瘦素主要作用于多系祖細胞階段，從而引起紅系、髓系、淋巴系造血細胞增殖。

有學者曾對46例慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜患者進行檢測，結(jié)果表明血清瘦素水平均升高，與血小板計數(shù)呈負相關(guān)，與血小板相關(guān)抗體IgG呈正相關(guān)[9]，其后通過進一步研究得出CITP患者血清瘦素水平升高的同時，可溶性瘦素受體(sOb-R)水平下降。瘦素可增強CITP患者脾細胞和外周血單個核細胞分泌血小板相關(guān)抗體IgG的能力。瘦素還可增加血小板活化T細胞[10]。以上這些發(fā)現(xiàn)說明瘦素可能與CITP的發(fā)病機制有關(guān)。

血小板生成與巨核細胞的正常凋亡密切相關(guān)，巨核細胞局部發(fā)生Caspase依賴的細胞凋亡啟動了血小板前體的形成，巨核細胞的凋亡受阻或不能發(fā)生正常形式的凋亡，會影響到血小板生成。CITP患者血清瘦素水平升高，血小板計數(shù)下降，本實驗旨在研究瘦素對CITP患者骨髓巨核細胞增殖分化與凋亡的影響來進一步探討ITP在巨核細胞方面的發(fā)病機制,從而為ITP的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 急性巨核細胞白血病細胞株M07e(中國醫(yī)學科學院血液病研究所)；重組人瘦素(美國R&D公司)；Agaros瓊脂糖(上海Yito公司)；BSA(Roche Diagnostics Corp)；淋巴細胞分離液(中國醫(yī)學科學院血研所科技公司)；GM-CSF(美國R&D公司)；M-MLV(美國GIBCO/BRL公司)；Oligo dT(上海生工生物工程公司)；DMSO(國產(chǎn)分析純)；谷氨酰氨(美國GIBCO公司)；重組人血小板生成素注射液(TPO)(沈陽三生制藥股份有限公司)；RPMI1640固體培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；牛血清白蛋白(Roche Diagnostics Corp)；SERUM-FREE MEDIUM(美國Stemcell公司)；Brdu-ELISA試劑盒(美國Roche公司)；Annexin V-FITC凋亡試劑盒(美國BD公司)。

1.2研究對象 10名CITP患者(7名女性，3名男性，中位年齡23歲)均為我院血液科住院患者。以急性巨核細胞白血病細胞株MO7e作為對照。所有病例均符合診斷標準。骨髓標本采集時,多數(shù)患者在接受糖皮質(zhì)激素和靜脈丙種球蛋白治療，少數(shù)應用免疫抑制劑治療。

1.3實驗方法

1.3.1M07e細胞培養(yǎng) M07e細胞復蘇后，接種于含20%FCS(胎牛血清)、5 ng/ml GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)、2 mM-谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素、100 IU/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。每1～2天傳代一次。取對數(shù)生長期的細胞進行各項實驗。

1.3.2RT-PCR檢測M07e細胞瘦素受體(長型和短型)mRNA表達 按Invitrogen公司Trizol總RNA分離試劑盒抽提總RNA。取2 μg RNA根據(jù)Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄酶體系轉(zhuǎn)錄為cDNA，按下述反應條件在PCR儀上進行擴增，94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 7 min，共35個循環(huán)。瘦素受體長型(Ob-RL) 和短型(Ob-RS)及作為內(nèi)參照的β-actin基因引物用軟件Primer Premier 5.0設計，Ob-RL的上下游引物分別為GCTATTTTGGGAAGATGT和TGCCTGGGCCTCTATCTC(501bp)；Ob-RS的上下游引物分別為CATTTTATCCCCATTGAGAAGTA和CTGAAAATTAAGTCCTTGTGCCCAG(271bp)；β-actin的上下游引物分別為CAGAGCAAGAGAGGCATCC和CTGGGGTGTTGAAGGTCTC(217bp)。擴增結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3Brdu(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)ELISA法檢測M07e細胞在瘦素作用后的增殖 取對數(shù)生長期的細胞，用含20%FCS、5 ng/ml GM-CSF的RPMI1640調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl，復種3孔，不同濃度的瘦素共培養(yǎng)，設7個瘦素濃度組(0、5、10、25、50、100、200 ng/ml)。同時以加TPO(50 ng/ml)組作為陽性對照,以排除假陰性結(jié)果。于37℃，5%CO2孵箱中分別培養(yǎng)24、48、72小時。實驗預設空白對照組和背景對照組：空白對照組不加細胞只加培養(yǎng)液和實驗試劑，背景對照組除不加標記液外其余條件同實驗組。嚴格按照美國Roche公司的Brdu ELISA試劑盒的操作步驟進行。加入終止液后盡快在5 min內(nèi)用酶標儀在450 nm波長處測光吸收值，參照波長690 nm。比色結(jié)果減去空白對照為實驗結(jié)果。背景對照旨在去除非特異性影響，應小于0.1。

1.3.4Annexin V/PI雙標流式檢測瘦素對M07e細胞的抗凋亡作用 取對數(shù)生長期細胞，用含20%FCS、5 ng/ml GM-CSF的RPMI1640調(diào)整濃度為5×105/ml接種于6孔細胞培養(yǎng)板中,每孔2 ml。設3個濃度的瘦素共培養(yǎng)(10、50、100 ng/ml)，分別于藥物作用24、48、72小時后收集細胞，以不加瘦素組作為對照。按照美國BD公司的AnnexinV-FITC凋亡試劑盒說明處理，將6個孔里細胞分別加入流式管中1000 r/min，4℃，5 min離心。棄上清，每管加1 ml冷PBS，輕震蕩使細胞懸浮。1000 r/min，4℃，5 min離心，棄上清。將細胞重懸于100 μl 1×binding buffer。加入5 μlAnnexinV-FITC和5 μl PI,輕輕混勻，避光室溫孵育15 min。每管加入400 μl 1×binding buffer，1小時內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1．3.5瘦素對CITP骨髓CD34+細胞向巨核系定向分化的影響

1.3.5.1CITP骨髓CD34+細胞的分選 采集骨髓10～20 ml，肝素鈉抗凝，用PBS(含2 mM EDTA)按1:1體積稀釋骨髓液，再用淋巴細胞分離液(Ficoll-Hypaque)分離單個核細胞(MNC)，按照德國美天旎公司CD34磁珠分選說明分選CD34+細胞。取2×105細胞分別標記PE-CD34+抗體,PE-Mouse IgG1(κ)同型對照，用流式細胞儀檢測CD34+細胞的純度。

1.3.5.2細胞培養(yǎng) 新鮮分離的骨髓CD34+細胞分別接種在含TPO(100 ng/ml)+SCF(50 ng/ml),TPO(100 ng/ml)+SCF(50 ng/ml)+Leptin(10 ng/ml),TPO(100 ng/ml)+SCF(50 ng/ml)+Leptin(50 ng/ml),TPO(100 ng/ml)+SCF(50 ng/ml)+Leptin(100 ng/ml)的無血清培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中，每孔終體積為1ml,細胞終濃度為1×105/ml，培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2，每3～4天半量換液，補充細胞因子，在第7、10、14天取出部分細胞進行計數(shù)，并作流式CD41a+、CD61+檢測。

1.3.5.3流式細胞儀測定培養(yǎng)細胞分化過程中CD41a+、CD61+的表達 取培養(yǎng)7、10、14天的細胞(5×105)離心去培養(yǎng)液，用PBS洗1次， 剩余約100 μl細胞懸液，分別加5 μl APC-CD41a，PE-CD61單抗,同型對照為Mouse APC-IgG1(κ),PE-IgG1(κ)單抗，混勻后室溫避光孵育30 min，離心去上清并用PBS洗2次，將細胞固定在0.4 ml 1%多聚甲醛中，流式細胞儀測定CD41a+細胞、CD61+細胞的表達。

1.3.6Annexin V-FITC單染法檢測瘦素對骨髓CD34+細胞誘導獲得的CD41a+細胞凋亡 取培養(yǎng)7、10、14天的細胞(5×105)離心去培養(yǎng)液，用PBS洗1次，將細胞重懸于100μl 1×binding buffer,加入5μl CD41a-APC和5μl AnnexinV-FITC,輕輕混勻,避光室溫孵育15 min,加400 μl 1×binding buffer，另外設一同型對照組，加入Mouse FITC-IgG1(κ),APC-IgG1(κ),1小時內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1.4統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計學分析采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析，各組之間兩兩比較用LSD方法。P≤0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳顯示瘦素受體長型Ob-RL和短型Ob-RS在501 bp和271 bp位置均有單一透亮條帶顯示(以β-actin為內(nèi)參照基因)，表明瘦素受體長型Ob-RL和短型Ob-RS在M07e細胞均有mRNA表達(圖1，圖2)。

圖1 瘦素受體(長型Ob-RL)的RT-PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.2Brdu-ELISA法M07e細胞增殖 與空白對照組相比，瘦素對M07e細胞的增殖有促進作用，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，濃度為5 ng/ml即顯示出促增殖效應(P=0.037)，但濃度在5、10、25 ng/ml之間無明顯統(tǒng)計學差異,兩兩之間相比P值分別為0.289，0.178，0.76。濃度為100 ng/ml時其增殖效應最大。在時間依賴效應上，瘦素作用48h，其細胞增殖明顯高于24 h，而作用72 h其細胞增殖介于兩者之間(P=0.000)。見圖3。

2.3Annexin V/PI雙標流式檢測M07e細胞凋亡 與不加瘦素組相比，瘦素對M07e細胞具有抑制凋亡作用(P=0.001)。濃度10，50，100 ng/ml之間無明顯統(tǒng)計學差異，兩兩之間相比P值分別為0.473,0.179,0.492。在時間依賴效應上瘦素作用72小時細胞凋亡率最高,兩兩相比P值均<0.05,24、48小時之間無明顯差異(P>0.05)。見圖4。

圖3 不同濃度瘦素作用于M07e細胞不同時間后Brdu統(tǒng)計結(jié)果(control為陽性對照，TPO濃度50ng/ml)

圖4 不同濃度瘦素作用于M07e細胞不同時間Annexin V/PI雙標流式統(tǒng)計結(jié)果

2.4.1CITP骨髓CD34+細胞的分選結(jié)果 收集10份標本,平均體積11.5 ml(10～15 ml),淋巴細胞分離液分離后,單個核細胞平均為(4.93±4)×107，經(jīng)過MACS磁珠分選后CD34+細胞平均為(1.2±0.65)×106,CD34+細胞純度可達95%以上。

2.4.2CITP骨髓CD34+細胞誘導分化過程中CD41a+、CD61+的表達情況 分別于培養(yǎng)第7、10、14天流式檢測不同濃度瘦素+TPO+SCF誘導分化過程中CD41a+、CD61+巨核細胞表達率，與不加瘦素組相比，培養(yǎng)第7、10天CD41a+、CD61+表達率有所增加，但兩兩相比P值均>0.05，無明顯統(tǒng)計學差異。培養(yǎng)第14天CD41a+、CD61+表達率較不加瘦素組有所減低，但也無統(tǒng)計學意義。在時間依賴效應上，隨著培養(yǎng)時間延長，各組CD41a+、CD61+表達率均增高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但與不加瘦素組相比無明顯差別。見表1。

2.5Annexin V-FITC單染法檢測骨髓CD34+細胞誘導獲得的CD41a+細胞凋亡 不同濃度Leptin+TPO+SCF誘導分化過程中CD41a+細胞凋亡率與不加瘦素組相比無統(tǒng)計學意義，兩兩相比P值均>0.05。隨著細胞培養(yǎng)時間的延長，各組凋亡率呈上升趨勢，但與不加瘦素組相比亦無明顯差別。見表2。

表1 不同時間各組細胞CD41a+、CD61+的表達率

表2 不同時間各組細胞凋亡率的比較

3 討 論

目前認為慢性ITP是一組與自身免疫有關(guān)的疾病。其機制為：抗體介導，即血小板表面有抗血小板的自身抗體，使致敏的血小板遭破壞；抗血小板抗體能與骨髓巨核細胞相結(jié)合,使之受損，導致成熟障礙，從而使血小板生成減少。

瘦素是一種具有重要生物活性的多肽類激素，是機體神經(jīng)一內(nèi)分泌一免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡中的重要成員，其在體內(nèi)的含量與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。研究瘦素在免疫相關(guān)性疾病中的發(fā)病機制倍受學者關(guān)注。瘦素受體屬于I型細胞因子受體家族，推測瘦素在造血調(diào)控、免疫細胞的發(fā)育及免疫應答中發(fā)揮重要作用。

瘦素為造血細胞的發(fā)育提供增殖信號，主要作用于多系祖細胞階段。骨髓中含有大量的脂肪組織，而且高百分比的脂肪細胞是保證建立長期骨髓培養(yǎng)所必需的關(guān)鍵基質(zhì)元素。脂肪也是瘦素的天然來源地，這可能說明脂肪細胞在骨髓或造血微環(huán)境中有產(chǎn)生瘦素的功能，由此來促進造血的進程。瘦素在生理狀態(tài)下可刺激正常髓細胞系和紅細胞系的發(fā)育[11]。

在免疫應答方面， T、B淋巴細胞表面均表達ob-R,表明瘦素可直接作用于淋巴細胞影響其功能。瘦素不僅在淋巴細胞生成中發(fā)揮促進作用，對于成熟淋巴細胞活化、增殖、執(zhí)行特異性免疫應答功能也顯示出重要作用。瘦素可能對記憶性T細胞的增殖具有抑制作用，而顯著增強初始性T細胞的增殖反應[12]。瘦素可誘導人Thl型細胞因子的產(chǎn)生，增強Thl促炎癥免疫應答，與健康對照組相比，ITP的患者血清瘦素水平顯著增高，推測瘦素誘導的Thl型病理性免疫應答可能與ITP的發(fā)病有關(guān)，并且有可能成為ITP治療的新靶點[11]。

CITP患者血清瘦素水平升高，與血小板計數(shù)呈負相關(guān)，與血小板相關(guān)抗體IgG呈正相關(guān)，而血小板相關(guān)抗體又可導致巨核細胞增殖和成熟障礙，這一關(guān)聯(lián)導致我們推測瘦素可能對巨核細胞起一定作用。

本實驗在研究ITP巨核細胞對瘦素的應答差異之前，先通過M07e為研究對象搞清楚瘦素對巨核細胞的作用。瘦素主要由白色脂肪組織分泌，血清瘦素的水平與脂肪的貯積量呈正比，近年研究證實瘦素與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[13-15]。本研究結(jié)果顯示M07e有瘦素受體的表達，與文獻報道的結(jié)果一致，提示血清中的瘦素可能通過M07e的受體來調(diào)節(jié)白血病細胞的增殖。腫瘤的生長是由于細胞的增生和和凋亡失衡而造成的。本研究中我們發(fā)現(xiàn)瘦素通過促進M07e細胞的增殖，抑制其凋亡來參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，具體機制有待于進一步研究。

TPO是近年純化克隆的巨核細胞一血小板系統(tǒng)的特異性造血調(diào)控因子。在巨核細胞的增殖、分化、成熟及血小板生成方面，TPO起重要調(diào)節(jié)作用。體內(nèi)外研究顯示其對正常人、某些血小板減少癥患者的骨髓巨核細胞增殖、成熟及血小板生成均有促進作用。近來有文獻報道,TPO 在誘導巨核細胞擴增的同時,尤其是培養(yǎng)后期,會特異性地誘導巨核細胞的凋亡。SCF能有效抑制TPO 介導的細胞凋亡,促進巨核細胞有效擴增,進一步說明體外擴增巨核細胞,SCF 與TPO 的聯(lián)合是必不可少的[16]。

本研究中我們用TPO與SCF聯(lián)合定向誘導CITP骨髓CD34+細胞向巨核系分化。用三種不同濃度的瘦素作用于其中，結(jié)果表明瘦素在TPO+SCF誘導CITP骨髓巨核細胞分化中無明顯協(xié)同作用，對分化產(chǎn)生的CD41a+細胞的凋亡也無明顯作用。提示瘦素在ITP的發(fā)病中可能主要是參與Th1型免疫應答，對骨髓巨核細胞的增殖和凋亡不足以作用，但研究例數(shù)較少，尚難作出肯定的結(jié)論，需要進一步加大樣本量進行研究。

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