閆輝 邢蔚 宋勇莉 王人鳳 陳俊 邱建華

在內(nèi)耳毛細(xì)胞保護(hù)性研究中，建立理想的動(dòng)物模型非常關(guān)鍵。目前應(yīng)用耳毒性藥物損傷耳蝸毛細(xì)胞建立耳聾動(dòng)物模型的方法很多，包括經(jīng)圓窗膜滲透卡鉑、順鉑[1，2]，肌肉注射硫酸卡那霉素(kanamycin sulfates,KM)、慶大霉素(gentamicin，GM))[3]，袢利尿劑聯(lián)合氨基糖苷類抗生素注射[4，5]等，國(guó)內(nèi)外使用耳毒性藥物建立耳聾動(dòng)物模型的研究主要集中在豚鼠和小鼠[6～8]，利用該方法建立大鼠耳聾模型的報(bào)道甚少。為此，本研究擬通過(guò)觀察并分析KM與呋塞米(furosemide,Fur)聯(lián)合使用建立快速致聾大鼠模型的效果，為藥物性聾相關(guān)研究建立快速有效的動(dòng)物模型提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用6周齡的雌性健康SD大鼠32只，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重120～150 g，耳廓反射靈敏，外耳道通暢，鼓膜完整且形態(tài)正常，實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)ABR反應(yīng)閾均正常。動(dòng)物隨機(jī)分為A組(注射KM+Fur后1天組)、B組(注射KM+Fur后7天組)、C組(注射KM+Fur后14天組)、D組(對(duì)照組)，每組8只動(dòng)物。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 水合氯醛來(lái)源于成都市科龍化工試劑廠；硫酸卡那霉素25萬(wàn)U/ml，來(lái)源于天津藥業(yè)焦作有限公司；呋塞米注射液2毫升/支，來(lái)源于上海和豐制藥有限公司；鬼筆環(huán)肽來(lái)源于美國(guó)Cytoskeleton公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)抗體來(lái)源于美國(guó)cell signaling technology公司；DAPI(4'，6-Diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚；Santa公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)步驟及方法

1.3.1快速致聾大鼠模型的建立 A、B、C三組分別經(jīng)腹腔一次性注射KM 500 mg/kg，30分鐘后再經(jīng)腹腔注射Fur 0.2 ml/kg，對(duì)照組按體重給予相同劑量生理鹽水腹腔注射。

1.3.2ABR測(cè)試 A、B、C三組于注射后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)、對(duì)照組于注射后1天分別進(jìn)行ABR測(cè)試，測(cè)試在隔聲屏蔽室內(nèi)用美國(guó)TDT公司的聽覺(jué)誘發(fā)電位工作站完成。方法：動(dòng)物以15%水合氯醛溶液腹腔注射(0.025 ml/kg)麻醉后置于恒溫板上，記錄電極置于顱頂正中，參考電極和接地電極分別放置在給聲側(cè)耳及鼠尾根部皮下，外置揚(yáng)聲器置于大鼠頭部前方45°，距離2 cm，正對(duì)外耳道；刺激聲為短純音(tone burst)，由MF1-S立體磁場(chǎng)揚(yáng)聲器輸出，刺激頻率20次/秒，掃描時(shí)間為10 ms，上升、下降時(shí)間為0.5 ms，間隔時(shí)間為45.517 ms，濾波范圍100～3 000 Hz，疊加1 024次，從90 dB SPL開始，按照5 dB降序依次檢測(cè)，以能引出Ⅲ波的最小刺激強(qiáng)度為ABR反應(yīng)閾，閾值小于20 dB SPL記為20 dB SPL，大于90 dB SPL記為90 dB SPL。依次檢測(cè)每只動(dòng)物的左右耳4、8、16、24、32 kHz反應(yīng)閾。

1.3.3基底膜鋪片免疫熒光染色及毛細(xì)胞計(jì)數(shù) 完成ABR測(cè)試后當(dāng)天每組隨機(jī)抽取2只大鼠行耳蝸基底膜鋪片及掃描電鏡觀察。動(dòng)物經(jīng)心臟灌注后，取出耳蝸組織，用3%戊二醛固定，10%EDTA脫鈣，耳蝸標(biāo)本置于顯微鏡下行基底膜全層剝離后，將標(biāo)本置于載玻片上，0.01M PBS(PH=7.2)清洗3次，滴加鬼筆環(huán)肽(1:200)，避光染色20分鐘；PBS(PH=7.2)清洗3次，吸干水分后，80%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，在毛細(xì)胞損傷最顯著的部位，600倍放大，連續(xù)抽取3個(gè)視野，計(jì)算毛細(xì)胞缺失率，取其平均值。如遇到視野周邊出現(xiàn)不完整的細(xì)胞，只記一邊，即記左不計(jì)右，記上不記下。

1.3.4掃描電鏡觀察 按上述方法固定耳蝸標(biāo)本后，挑去骨性蝸殼，去除螺旋韌帶，血管紋，前庭膜及蓋膜，置于3%戊二醛內(nèi)送第四軍醫(yī)大學(xué)電鏡中心，2%單寧酸導(dǎo)電染色，梯度乙腈脫水，醋酸異戊酯過(guò)渡，干燥、鍍膜后，掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.5免疫熒光觀察cleaved caspase-3的表達(dá) ABR測(cè)試后，各組取2只動(dòng)物，按上述方法，取出耳蝸組織，將固定好的經(jīng)EDTA脫鈣一周的耳蝸標(biāo)本置于30%蔗糖溶液中脫水，過(guò)夜后，置于OCT膠中包埋固定，沿蝸軸水平切片，切片厚度為10 μm。切片制備完善后，0.01M PBS(PH=7．2)清洗3次，0.1% TritonX- 100打孔，室溫，15分鐘，再置于5%小牛血清封閉液中，37℃，1 h后，吸去封閉液勿洗，加一抗兔來(lái)源cleaved caspase-3抗體1:50，于4℃孵育過(guò)夜，0.01M PBS(PH=7.2)清洗3次，加入二抗(1:200熒光染料594標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體)(Invitrogen公司)，室溫孵育1 h，DAPI染色，80%甘油封片。熒光顯微鏡拍照觀察，通過(guò)專業(yè)圖像分析軟件Image Pro Plus(IPP)行熒光半定量檢測(cè)，測(cè)得各組光密度值。陽(yáng)性染色為胞漿染色為紅色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠ABR檢測(cè)結(jié)果 A、B、C組各頻率ABR均較正常對(duì)照組明顯升高，尤以高頻升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而A、B、C組之間各頻率ABR反應(yīng)閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠各頻率ABR反應(yīng)閾

注：#與D組比較，P<0.05

圖1 各組基底膜底回鋪片鬼筆環(huán)肽染色(×600) a～d分別為A～D組

圖3 各組螺旋神經(jīng)節(jié)cleaved caspase-3免疫熒光染色圖像(×600)a、e為A組，b、f為B組，c、g為C組,d、h為D組，紅色為cleaved caspase-3染色，藍(lán)色為DAPI襯核

2.2各組基底膜鋪片的比較 A、B、C組耳蝸底回外毛細(xì)胞與正常對(duì)照組相比可見(jiàn)明顯缺失，正常對(duì)照組毛細(xì)胞排列整齊，無(wú)缺失(圖1)；A、B、C組毛細(xì)胞總?cè)笔史謩e為39.53%、41.08%和39.42%，三組間毛細(xì)胞缺失率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A、B、C組毛細(xì)胞缺失率高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組耳蝸基底膜掃描電鏡觀察 A、B、C組大鼠基底膜底回各排外毛細(xì)胞纖毛均有缺失，排列紊亂，倒伏，與基底膜鋪片結(jié)果一致，而正常對(duì)照組毛細(xì)胞排列整齊，無(wú)纖毛缺失、倒伏等現(xiàn)象(圖2)。

2.4各組螺旋神經(jīng)節(jié)cleaved caspase-3的免疫熒光表達(dá) 熒光顯微鏡下cleaved caspase-3在正常對(duì)照組細(xì)胞漿染色為陰性，A、B、C組熒光顯色均為陽(yáng)性(圖3)。A、B、C組螺旋神經(jīng)節(jié)的免疫熒光染色平均光密度值分別為77.83±6.12、76.56.±2.74及85.68±4.72，正常對(duì)照組為21.36±5.17，A、B、C三組的光密度值高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

3 討論

氨基糖苷類抗生素的耳毒性機(jī)制至今仍不完全清楚，Yamane等[9，10]發(fā)現(xiàn)袢利尿劑可以促進(jìn)KM進(jìn)入內(nèi)耳淋巴液，并推測(cè)其可能與袢利尿劑增強(qiáng)KM耳毒性的效應(yīng)有關(guān)。速尿或利尿酸等藥物與KM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可導(dǎo)致腎功能衰竭，在短時(shí)間內(nèi)可極大提高血漿和外淋巴液中KM的濃度，同時(shí)抑制KM從腎排泄，從而導(dǎo)致耳蝸功能發(fā)生不可逆的改變。既往研究[11～13]表明，卡那霉素和速尿聯(lián)合應(yīng)用可嚴(yán)重?fù)p傷成年豚鼠耳蝸毛細(xì)胞，且外毛細(xì)胞受損重于內(nèi)毛細(xì)胞，耳蝸底回毛細(xì)胞受損重于頂回。從文中結(jié)果看，KM和Fur聯(lián)合用藥后第1天大鼠的ABR反應(yīng)閾明顯升高，給藥后第1天組、第7天組及第14天組ABR反應(yīng)閾均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，其中以高頻反應(yīng)閾升高更明顯，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。

Caspase家族是一類半胱氨酸蛋白質(zhì)酶，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，具有特異性水解底物分子天冬氨酸(Asp)殘基C端肽鍵功能，是近年發(fā)現(xiàn)的重要凋亡分子[14]。凋亡蛋白質(zhì)-3(caspase-3)被認(rèn)為是多種組織、細(xì)胞類型中最常涉及的凋亡效應(yīng)分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。近年來(lái)的研究[15]顯示，caspase-3正常情況下以酶原(32 KD)的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；耳蝸外毛細(xì)胞是氨基糖苷類抗生素的主要靶點(diǎn)，曾有研究[16～18]也觀察到，連續(xù)應(yīng)用小劑量卡那霉素2周后，耳蝸毛細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯高于正常對(duì)照組，內(nèi)毛細(xì)胞的丟失導(dǎo)致了永久性的聽覺(jué)喪失，并可引起螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的退化。本研究結(jié)果可見(jiàn)A、B、C三組的cleaved caspase-3的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明這三組動(dòng)物在聽力下降時(shí)有螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，藥物性聾與內(nèi)耳毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡有密切關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證了cleaved caspase-3參與了藥物性聾大鼠的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡過(guò)程。

綜上所述，KM和Fur一次性腹腔注射給藥在用藥后24小時(shí)大鼠即出現(xiàn)ABR反應(yīng)閾明顯高于正常對(duì)照組，且給藥后14天內(nèi)無(wú)顯著變化，提示該快速致聾方法導(dǎo)致的聽力下降有一定的穩(wěn)定性，且操作簡(jiǎn)單有效，可明顯縮短造模時(shí)間，為藥物性聾實(shí)驗(yàn)研究提供了一種簡(jiǎn)單、快速而有效的動(dòng)物模型造模方法。由于本研究采用的KM+Fur致聾劑量比較單一，致聾后觀察時(shí)間僅限于14天內(nèi)，有一定的局限性，因此，對(duì)于藥物致聾的濃度與效應(yīng)之間的關(guān)系，以及藥物性聾發(fā)病機(jī)制等，還有待于今后更進(jìn)一步的研究。

4 參考文獻(xiàn)

1 Zhou Y，Ding D，Kraus KS，et al．Functional and structural changes in the chinchilla cochlea and vestibular system following round window application of carboplatin[J]．Audiol Med，2009，7：189．

2 He J，Yin S，Wang J，et al.Effectiveness of different approaches for establishing cisplatin-induced cochlear lesions in mice[J]．Acta Otolaryngol，2009，129：1 359．

3 丁大連， 蔣濤，丌衛(wèi)東，等．內(nèi)耳科學(xué)[M]．北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2010.222～223．

4 West BA，Brummett RE，Himes DL．Interaction of kanamycin and ethacrynic acid．Severe cochlear damage in guinea pigs[J]．Arch Otolaryngo1,1973，98：32．

5 Nourski KV，Miller CA，Hu N，et al．Co-administration of kanamycin and ethacrynie acid as a deafening method for acute animal experiments[J]．Hear Res，2004，187：131．

6 Astbury PJ. Read NG. Kanamycin induced ototoxicity in the laboratory rat: a comparative morphological and audiometric study[J]. Arch Toxicol,1982， 50:267．

7 Murillo-Cuesta S，Garcia-Alcfintara F，Vacas E，et al．Direct drug application to the round window：a comparative study of ototoxicity in rats[J]．Otolaryngol Head Neck Surg,2009，141：584．

8 Wu WJ，Sha SH，McLaren JD，et al．Aminoglycoside ototoxicity in adult CBA，C57BL and BALB mice and the Sprague-Dawley rat[J]．Hear Res，2001，158：165．

9 張賢芬，楊仕民，胡吟燕，等.聯(lián)合應(yīng)用卡那霉素和速尿的豚鼠耳蝸毒性實(shí)驗(yàn)觀察[J].中華耳科學(xué)雜志,2008,6:166．

10 Gibbs RA, Weinstock GM， Metzker ML. Genome sequence of the brown Norway rat yields insights into mammalian evolution[J].Nature，2004，428：475．

11 Yang JH，Liu ZH．Apoptosis of cochlear cells and hearing threshold in guinea pigs with kanamucin-induced chronic intoxication[J].Chinese Journal of Clinical Rehabilitation，2005，9:30．

12 楊俊慧，劉兆華.卡那霉素耳慢性中毒后豚鼠耳蝸細(xì)胞凋亡的觀察[J].中國(guó)耳鼻咽喉科雜志，2004，4：91．

13 He J，Yin S，Wang J，et al.Effectiveness of different approaches for establishing cisplatin-induced cochlear lesions in mice[J]. Acta Otolaryngol,2009,12:1 359．

14 Geal-Dor M，F(xiàn)reeman S，Li G,et al．Development of hearing in neonatal rats：air and bone conducted ABR thresholds[J]．Hear Res, 1993,69：236．

15 鄔莎，王愛(ài)梅.Caspase家族與內(nèi)耳細(xì)胞凋亡[J].國(guó)際耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,6:317．

16 Jad W, Cristina P, Fiona LS,et al. A constitutively active and uninhibitable caspase-3 zymogen efficiently induces apoptosis[J]. Biochem J,2009,424:335．

17 Suparna M, Dragos P, Alexandru A, et al. Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis[J]. Methods in Molecular Biology, 2008,414:13．

18 Shepherd JD, Bear MF. New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticiticy[J]. Nat Neurosci, 2011,14:279.