劉芳利 羅彬 孫敬武 陳浩

γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid ，GABA )是成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為廣泛和重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它與大多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)密切相關(guān)。既往大量實(shí)驗(yàn)研究[1～3]指出，外周聽(tīng)器損傷、老年性聾、藥物性聾或耳鳴、噪聲暴露導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)功能變化后,中樞聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)中GABA的功能都會(huì)發(fā)生變化。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GABA主要來(lái)源于谷氨酸的脫羧基作用,其主要限速酶為谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)，GAD有GAD65和GAD67兩個(gè)亞型，它們?cè)谡麄€(gè)神經(jīng)元中均有分布，GAD65主要分布于神經(jīng)末梢，而GAD67主要位于胞體。大多數(shù)GAD65以不太活躍的脫輔基酶的形式存在[4～6]，而GAD67的輔基則已飽和，在反應(yīng)中非?；钴S，因此，GAD67作為觀測(cè)GABA水平變化的指標(biāo)更加敏感。

聽(tīng)皮層是聽(tīng)覺(jué)信息識(shí)別、整合和處理的基礎(chǔ)，是中樞聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的重要組成部分。同時(shí)，聽(tīng)皮層是聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路神經(jīng)元數(shù)量最多的部位之一[7]。因此，與聽(tīng)覺(jué)相關(guān)的蛋白質(zhì)在聽(tīng)皮層的表達(dá)量在整個(gè)聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路中具有一定的代表性。本研究擬通過(guò)觀察噪聲暴露后大鼠聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)及聽(tīng)皮層GAD67陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的變化，初步探討噪聲性聽(tīng)損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用2～4月齡、體重200～250 g健康雌性SD大鼠21只為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，所有動(dòng)物耳廓反射正常，耳鏡檢查未見(jiàn)明顯異常，無(wú)耳毒性藥物史及強(qiáng)噪聲暴露史，實(shí)驗(yàn)前雙耳ABR反應(yīng)閾在25 dB SPL以內(nèi)。將大鼠隨機(jī)分成 0、7、14天組，每組7只，并分別標(biāo)記，每組大鼠再隨機(jī)分為對(duì)照組(3只)和暴露組(4只)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1噪聲暴露動(dòng)物模型的建立 所有暴露組動(dòng)物于清醒狀態(tài)下，在隔聲室內(nèi)置入專用器皿，揚(yáng)聲器距離大鼠頭部25 cm，雙耳暴露于頻率為4 kHz以上、100 dB SPL白噪聲2小時(shí)。聲音由軟件Adobe audition3，Version 3 生成，由MATRX M-640功放系統(tǒng)(杭州奧斯通)控制,CP-75A揚(yáng)聲器(上海創(chuàng)木)給聲。

1.2.2ABR檢測(cè) 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于噪聲暴露前測(cè)試ABR，暴露組大鼠再于暴露后0天(0.5～2小時(shí))、第7天、第14天測(cè)試ABR，對(duì)照組大鼠于各暴露組對(duì)應(yīng)時(shí)間分別檢測(cè)ABR。各組動(dòng)物經(jīng)腹腔注射7%的水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后，用TDT系統(tǒng)(包括模塊ED1，PA5，RP2，RA16，美國(guó)TDT公司)檢測(cè)ABR。測(cè)試電極置于兩耳連線水平頭頂正中，接地電極置于大鼠鼻尖，參考電極置于對(duì)側(cè)乳突。刺激聲采用click聲，間隔為10次/秒，以開(kāi)放聲場(chǎng)給聲，揚(yáng)聲器(ESN SN 3389，美國(guó)TDT公司)距離大鼠測(cè)試耳外耳門1 cm。濾波范圍100～3 000 Hz，平均疊加1 000次。ABR波形采用美國(guó)TDT公司的BioSigRP記錄、分析，以能引出波Ⅲ的最小刺激強(qiáng)度為大鼠ABR反應(yīng)閾。

1.2.3聽(tīng)皮層GAD67表達(dá)量檢測(cè) 各組大鼠分別于暴露后0天(2～4小時(shí)內(nèi))、第7天、第14天完成ABR測(cè)試后，于水合氯醛深麻醉下，先予PBS 100 ml、 4%多聚甲醛300 ml行心臟灌注后取腦組織，4%多聚甲醛后固定后冰凍切片機(jī)(CM 1950，德國(guó)Leica)冠狀位連續(xù)切片，片厚30 μm。按照大鼠腦組織立體定位圖譜，每只大鼠隨機(jī)取5張含聽(tīng)皮層腦片進(jìn)行染色。漂片法行GAD67陽(yáng)性神經(jīng)元標(biāo)記，一抗為鼠抗GAD67單克隆抗體(ab26116，英國(guó)ABcam)，二抗來(lái)自通用型免疫組化試劑盒(SP-9001，北京中杉)。DAB法染色，材料為濃縮型DAB試劑盒(ZLI-9017，北京中杉)。免疫組化圖像用光學(xué)顯微鏡(Axioskop 2 plus，德國(guó)Zeiss)觀察，用Axiovision圖像系統(tǒng)采集圖像。采集圖像范圍：在含聽(tīng)皮層的腦片上，嗅溝向上1 mm處，10倍目鏡下，由聽(tīng)皮層表面向內(nèi)取連續(xù)的3個(gè)20倍物鏡視野，觀察GAD67染色陽(yáng)性神經(jīng)元，用每平方毫米(mm2)聽(tīng)皮層平均陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量表示GAD67水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠ABR反應(yīng)閾 由表1可見(jiàn)，暴露組大鼠噪聲暴露后各時(shí)間點(diǎn)ABR反應(yīng)閾較暴露前均有提高，最高達(dá)39.58±8.10 dB SPL，噪聲暴露后0～14天其聽(tīng)力逐漸恢復(fù)，ABR反應(yīng)閾呈下降趨勢(shì)，到第14天時(shí)平均為21.25±4.78 dB SPL。暴露后0天(0.5～2小時(shí))暴露組ABR反應(yīng)閾較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，第7、14天時(shí)暴露組與對(duì)照組ABR反應(yīng)閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 暴露組與對(duì)照組噪聲暴露前后ABR反應(yīng)閾比較(dB SPL)

注：*與對(duì)照組相比，P<0.01

2.2各組聽(tīng)皮層GAD67表達(dá)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量 對(duì)照組與暴露組聽(tīng)皮層中均有GAD67表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元(圖1)。各組噪聲暴露后不同時(shí)間聽(tīng)皮層GAD67表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元計(jì)數(shù)見(jiàn)表2，可見(jiàn)，噪聲暴露后0天(2～4小時(shí))暴露組大鼠聽(tīng)皮層GAD67表達(dá)陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量比對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，第7天和第14天暴露組GAD67陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 暴露后不同時(shí)間免疫組化染色結(jié)果

圖中箭頭示GAD67陽(yáng)性神經(jīng)元。暴露后0天暴露組GAD67陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目(b)明顯多于對(duì)照組(a)，暴露后14天時(shí)GAD67陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目(d)低于同期對(duì)照組(c)

表2 各組大鼠噪聲暴露后聽(tīng)皮層GAD67陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量(個(gè)/mm2)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01,**P<0.05

3 討論

近年來(lái)對(duì)噪聲暴露的強(qiáng)度、頻率、持續(xù)時(shí)間與聽(tīng)覺(jué)器官受損范圍及程度的關(guān)系有較多研究，Abbott等[8]將大鼠暴露于10 kHz、100 dB強(qiáng)聲9小時(shí), 觀察到動(dòng)物的各頻率ABR反應(yīng)閾均提高25～30 dB SPL，30天后除了10～20 kHz外，其它頻率ABR反應(yīng)閾均與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；有研究者將南美栗鼠暴露于中心頻率為4 kHz的倍頻帶、86 dB SPL的噪聲中24小時(shí)，暴露后所有動(dòng)物在4～12 kHz ABR反應(yīng)閾平均提高43 dB SPL，短時(shí)間內(nèi)部分動(dòng)物ABR反應(yīng)閾完全恢復(fù)，而部分動(dòng)物某些頻率ABR反應(yīng)閾在觀察期內(nèi)持續(xù)升高，個(gè)體差異明顯[9]；Cherylea[10]將大鼠單耳暴露于中心頻率16 kHz、1/10倍頻、115 dB SPL噪聲中1小時(shí)，暴露后所有動(dòng)物均有ABR反應(yīng)閾的升高，第8天時(shí)除了某些高頻ABR反應(yīng)閾持續(xù)升高外，低頻基本恢復(fù)正常，而到32天時(shí)動(dòng)物各頻率ABR反應(yīng)閾再次升高；Pouyatos等[11]將大鼠暴露于8 kHz、97 dB SPL的噪聲6小時(shí)/天，每周5天，持續(xù) 4 周后動(dòng)物ABR反應(yīng)閾平均提高27 dB SPL,短期內(nèi)ABR反應(yīng)閾未恢復(fù)；Turner等[12]給予動(dòng)物同樣的噪聲暴露后，經(jīng)過(guò)4個(gè)月的恢復(fù)時(shí)間各頻率ABR反應(yīng)閾依然很高；Bauer[13]給予動(dòng)物16 kHz、105 dB SPL的聲刺激1小時(shí)，觀察到7個(gè)月后其ABR反應(yīng)閾仍高于正常，而另有作者觀察到大鼠暴露于中心頻率為17 kHz倍頻帶、116 dB SPL噪聲1小時(shí)，16周后聽(tīng)力完全恢復(fù)[14]。上述研究結(jié)果的多樣性可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異、噪聲暴露的性質(zhì)、研究者的不同研究目的有關(guān)，但這些研究的共同點(diǎn)是噪聲暴露未導(dǎo)致受試動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)的完全喪失，多數(shù)動(dòng)物ABR反應(yīng)閾提高的程度在30 dB SPL以內(nèi)，其中大部分研究證明噪聲暴露導(dǎo)致16 kHz和32 kHz的聽(tīng)力損失最嚴(yán)重。

本研究結(jié)果顯示，大鼠暴露于頻率4 kHz以上、100 dB SPL白噪聲中2小時(shí)后其ABR反應(yīng)閾較暴露前明顯提高，這與大部分學(xué)者的結(jié)果相符；噪聲暴露后14天時(shí)，大鼠的ABR反應(yīng)閾與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明此種性質(zhì)的噪聲導(dǎo)致了大鼠聽(tīng)力的暫時(shí)性閾移。噪聲暴露導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)功能受損的因素很多，而外周聽(tīng)器中的組織結(jié)構(gòu)及功能變化包括：柱狀體的屈曲膨脹、外毛細(xì)胞的靜纖毛與柯替氏膜解耦和[9]、毛細(xì)胞靜纖毛的損傷，耳蝸內(nèi)電位的抑制和鄰近傳入神經(jīng)的損傷等。目前，大部分學(xué)者認(rèn)為哺乳動(dòng)物損失的毛細(xì)胞及傳入神經(jīng)損傷后不能自主再生，可能與永久性閾移的發(fā)生相關(guān)，而柱狀體的形態(tài)改變、毛細(xì)胞與柯替氏膜之間的功能改變以及耳蝸內(nèi)電位的抑制在經(jīng)過(guò)短時(shí)間的休息后則能恢復(fù)正常，這幾種改變可能是暫時(shí)性閾移的主要原因，由此推論，本研究中噪聲暴露后大鼠外周聽(tīng)器的變化可能局限于后幾種結(jié)構(gòu)改變。

大量的研究證明機(jī)體承受急性壓力和刺激后將出現(xiàn)GAD67水平的迅速升高。Bowers等[15]發(fā)現(xiàn)急性應(yīng)激反應(yīng)將引起神經(jīng)傳導(dǎo)通路中GAD67水平明顯升高，而這種變化同樣出現(xiàn)在大腦皮質(zhì)的局部缺血后[16]。也有學(xué)者指出小腦傳入神經(jīng)受刺激后可增加GAD67的mRNA表達(dá)，提高了其活性[17]。Abbott等[8]用蛋白質(zhì)印跡和免疫組化兩種方法檢測(cè)噪聲暴露結(jié)束后大鼠的下丘GAD67的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量明顯升高。本研究也顯示噪聲暴露后2～4小時(shí)內(nèi)大鼠的聽(tīng)皮層GAD67表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)量明顯增多。有學(xué)者提出GAD67的升高可能與GABA的新陳代謝活躍程度相關(guān)[18]，強(qiáng)噪聲刺激會(huì)導(dǎo)致下丘中新陳代謝變化，GABA代謝活躍,可能是GAD67在噪聲暴露后早期增多的原因。另外，亦有學(xué)者通過(guò)免疫組化的方法對(duì)貓的視覺(jué)系統(tǒng)中GAD表達(dá)及分布進(jìn)行研究，提出對(duì)于外界刺激GAD67可能參與了一個(gè)相對(duì)滯后但更復(fù)雜的反應(yīng)[19]，但不論其機(jī)制如何，噪聲暴露后早期GAD67的升高都反映了機(jī)體對(duì)于外界不良刺激做出的反應(yīng)。

在Abbott[8]的試驗(yàn)中，在聲暴露結(jié)束后2天下丘中GAD67水平即從升高恢復(fù)到正常，而到第30天時(shí)僅為對(duì)照組的21%。Cherylea[10]觀察到大鼠單耳噪聲暴露后，對(duì)側(cè)下丘和背側(cè)耳蝸核中GAD67的表達(dá)先輕度升高，隨后降低，并在足夠長(zhǎng)時(shí)間后恢復(fù)到正常水平。除此之外還有很多實(shí)驗(yàn)證明在噪聲暴露后下丘的抑制功能減弱[18,20～23]。從文中結(jié)果看，在噪聲暴露后第7天和第14天時(shí)，大鼠聽(tīng)皮層中GAD67的量較對(duì)照組明顯降低，與既往試驗(yàn)中聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)其它部位的抑制功能相關(guān)蛋白質(zhì)的變化規(guī)律一致，這可能是由于噪聲暴露造成了外周聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)及神經(jīng)末梢的損害，甚至導(dǎo)致傳入神經(jīng)阻滯和神經(jīng)傳導(dǎo)通路中選擇性的損傷，從而使噪聲暴露停止后興奮性信號(hào)傳入減少；機(jī)體為達(dá)到一種穩(wěn)態(tài)，對(duì)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的釋放也減少，因此，對(duì)GAD67需求量也減少，導(dǎo)致觀察部位GAD67陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的減少；而噪聲暴露后聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)中GABA和GAD67水平的降低，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)自發(fā)電活動(dòng)、同步性和興奮性的增加[24,25]，這可能與噪聲暴露后耳鳴的發(fā)生機(jī)理有關(guān)。

綜上所述，大鼠于頻率4 kHz以上、100 dB SPL白噪聲中暴露2小時(shí)后可出現(xiàn)聽(tīng)覺(jué)功能受損，ABR反應(yīng)閾發(fā)生了暫時(shí)性閾移，且聽(tīng)皮層GAD67表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)目先增多后減少，直到暴露后第14天時(shí)仍低于對(duì)照組，提示聽(tīng)皮層內(nèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA在噪聲暴露后短時(shí)間內(nèi)升高，此后逐漸降低，直至觀察期結(jié)束仍處于較低水平，這可能是噪聲性聾、耳鳴及其它聽(tīng)覺(jué)功能異常的發(fā)病機(jī)制之一。

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