孟憲慧，張治國(guó)，向麗華

(1.北京市豐臺(tái)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 100072;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700)

偏頭痛以反復(fù)發(fā)作的一側(cè)或雙側(cè)頭角痛和自主神經(jīng)功能紊亂為主要臨床特征，是社區(qū)中醫(yī)全科門診的常見疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“頭風(fēng)”范疇。從經(jīng)絡(luò)循行看，病位在手足少陽經(jīng)、手少陽三焦經(jīng)頭部走形為“上項(xiàng)，系耳后，直上出耳上角”，其病機(jī)多由于外邪侵襲少陽經(jīng)脈、肝火夾痰夾瘀阻塞少陽經(jīng)脈、脈絡(luò)不通，不通則痛，臨床多選用少陽經(jīng)穴治療偏頭痛。筆者在另一臨床實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，選用少陽經(jīng)穴遵循“腧穴所在，主治所在”的局部取穴原理和“經(jīng)脈所通，主治所及”的遠(yuǎn)道取穴原理，采用遠(yuǎn)近配穴針刺治療偏頭痛取得較好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)旨在通過復(fù)制實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型，通過檢測(cè)血清中CGRT、ET-1含量，探索遠(yuǎn)近配穴法針刺治療偏頭痛的治療效果及作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SD大白鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量180～290 g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(許可證編號(hào)SCXK(京)2009-0017)。動(dòng)物清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度40% ～70%，噪音＜60分貝，換氣次數(shù)10～20次/min。

1.2 主要藥物和試劑

硝酸甘油注射液由廣東白云山明興制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)100704)，1ml硝酸甘油含量為5 mg;降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)ELISA試劑盒和內(nèi)皮素-1(ET-1)ELISA試劑盒，均來自于上海越研生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分組及干預(yù)方法

將健康SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、非穴組、遠(yuǎn)近配穴組4組。干預(yù)方法:正常組SD大鼠不做任何處理，作為正常對(duì)照組;模型組造模成功后不做針刺處理;非穴組選取雙側(cè)肋下2個(gè)固定非穴點(diǎn)作為對(duì)照刺激點(diǎn);遠(yuǎn)近配穴組采用“遠(yuǎn)近配穴”法，局部選穴風(fēng)池、配伍遠(yuǎn)端選穴中渚、外關(guān)。非穴組和遠(yuǎn)近配穴組均根據(jù)華興邦等制作的大鼠穴位圖譜[1]選穴。2組均于造模術(shù)后30 min行針刺手法，留針20 min。

2.2 模型制備

參考倪麗偉等[2]方法，在大鼠頭部(額顳部)皮下注射硝酸甘油(10 mg/kg)，復(fù)制實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型。

2.3 取材、處理

將動(dòng)物斷頭處死、打開腹腔，用負(fù)壓采血器收集腹主動(dòng)脈血約10 mL，注入含0.3 mg肝素鈉的冰冷試管中輕輕搖勻。然后，4℃3000 r/min離心10 min，分離血漿，按編號(hào)放入低溫冰箱中，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血漿CGRP及ET-1含量測(cè)定方法

2.4.1 血漿CGRP含量測(cè)定方法(放免法)[3]

將備用的血漿置于室溫中復(fù)融后混勻，再次4℃3000 r/min離心10 min。取上層清液0.5 mL，加1 mL酸性無水乙醇(100 mL無水乙醇加1.2 mL冰醋酸)振蕩1 min，4℃ 3500 r/min離心15 min。將上層清液倒入青霉素小瓶?jī)?nèi)，45℃水浴蒸干，樣品完全干燥后(約24 h)加蓋、封口，－20℃放存。測(cè)定時(shí)，每瓶加pH7.4 PBS 0.5 mL溶解、混勻，倒入塑料試管中，－20℃放存4 h以上，樣品完全凍結(jié)后取出放置。4℃情況下完全溶解后，取上清液200 mL檢測(cè)。取聚苯乙烯試管編號(hào)，按說明書中CGRP RIA加液程序進(jìn)行操作后充分混勻，室溫放置20 min，4℃ 3500 r/min離心25 min，吸棄上清液，在r計(jì)數(shù)器上測(cè)定各管中沉淀的放射性計(jì)數(shù)cpm，F(xiàn)J-2003r自動(dòng)計(jì)數(shù)器可以直接得到樣品CGRP的血濃度。

2.4.2 血漿ET-1含量測(cè)定方法(放免法)[3]

將備用的血漿置于室溫中復(fù)融混勻，4℃ 3000 r/min離心5 min，取上層清液100 μL檢測(cè)。取聚苯乙烯試管編號(hào)，按說明書中ET RIA加液程序操作后充分混勻，室溫放置15 min，4℃ 3500 r/min離心15 min，吸棄上清液，測(cè)各管中沉淀的放射性計(jì)數(shù)cmp，在FJ-2003r自動(dòng)計(jì)數(shù)器上可以直接讀出ET-1的血濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組組間比較，各針刺治療組與模型對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，非經(jīng)非穴組與遠(yuǎn)近配穴組間進(jìn)行比較。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài)觀察

除空白對(duì)照組外，其余動(dòng)物造模后30 min左右均出現(xiàn)耳紅、前肢頻繁搔頭、爬籠次數(shù)增多、煩躁不安現(xiàn)象。遠(yuǎn)近配穴針刺治療組大鼠在針刺治療5 min開始，上述現(xiàn)象逐漸消失趨于正常。模型組及非經(jīng)非穴針刺治療組大鼠上述現(xiàn)象持續(xù)不能緩解約150 min，繼而出現(xiàn)蜷臥、活動(dòng)減少狀態(tài)。

3.2 針刺對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠模型血漿中CGRP、ET-1含量的影響

表1顯示，模型對(duì)照組CGRP含量明顯升高，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);非經(jīng)非穴針刺治療后，CGRP含量有所下降，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);經(jīng)遠(yuǎn)近配穴針刺治療后大鼠血中CGRP含量顯著下降，與模型對(duì)照組和非經(jīng)非穴組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。提示遠(yuǎn)近配穴針刺治療實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型，有顯著降低動(dòng)物血中CGRP含量的作用，其治療效果明顯優(yōu)于非經(jīng)非穴針刺治療組。

表1 遠(yuǎn)近配穴法針刺對(duì)偏頭痛大鼠模型血漿中CGRP、ET-1含量的影響

本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組動(dòng)物血中ET-1含量明顯降低，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);非經(jīng)非穴針刺治療后ET-1含量有所升高，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);經(jīng)遠(yuǎn)近配穴針刺法治療后大鼠血中ET-1含量顯著升高，與模型對(duì)照組和非經(jīng)非穴組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。提示遠(yuǎn)近配穴針刺法治療實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型可以顯著升高動(dòng)物血中ET-1含量，其效果明顯優(yōu)于非經(jīng)非穴組。

4 討論

近年來，對(duì)偏頭痛發(fā)生機(jī)制的研究多集中于各種血管神經(jīng)肽類物質(zhì)。姚干[3]等研究表明，在硝酸甘油誘發(fā)的實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型血漿中，具有強(qiáng)烈舒張血管作用的神經(jīng)肽降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的含量升高，具有強(qiáng)烈收縮血管作用的內(nèi)皮素(ET)含量降低。血漿中CGRP、ET含量的不平衡，是偏頭痛發(fā)作時(shí)的重要機(jī)理。我們?cè)诹硪慌R床研究中證實(shí)，采用遠(yuǎn)近配穴法針刺治療偏頭痛，可以有效改善偏頭痛發(fā)作時(shí)的疼痛程度，控制發(fā)作頻率。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，遠(yuǎn)近配穴針刺法治療前后大鼠的行為特征發(fā)生明顯變化，說明遠(yuǎn)近配穴針刺法可以明顯減輕硝酸甘油誘發(fā)的偏頭痛。實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型大鼠血漿中CGRP含量升高、ET-1含量降低。經(jīng)遠(yuǎn)近配穴法針刺治療后，CGRP含量降低、ET-1含量升高。表明遠(yuǎn)近配穴法針刺治療使實(shí)驗(yàn)性偏頭痛大鼠模型血漿中CGRP和ET-1的含量達(dá)到一個(gè)相對(duì)平衡狀態(tài)，從而起到治療偏頭痛的作用。

[1]華興邦，李辭榮，周浩良，等.大鼠穴位圖譜的研制[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，1991(1):1.

[2]倪麗偉，馬莎，陳祥芳，等.針刺對(duì)實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型大鼠行為學(xué)癥狀的影響[J].福建中醫(yī)學(xué)，2008，6(39):49-50.

[3]姚干，陳明嶺，任永欣.頭風(fēng)膠囊對(duì)偏頭痛大鼠血中CGRP、ET和His含量的影響[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，12(24):38-41.