廖 軍，謝巧瑜，張 樂，鄭佳璇，柯玫瑰，黃萍萍

(1.福建中醫(yī)藥大學針灸學院，福州 350122;2.廈門市第二醫(yī)院海滄分院康復理療科，廈門 361026)

隨著現代生活方式改變，頸椎病發(fā)病率逐年升高，其發(fā)生發(fā)展的根本原因為頸椎間盤退變[1]。大多認為，椎間盤細胞外基質的降解與基質黏附功能減弱導致的細胞凋亡是導致頸椎間盤退變的兩個重要因素[2]。一方面，基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)是降解細胞外基質的重要蛋白酶，在椎間盤退變中起重要作用，其中的基質金屬蛋白酶-l(MMP-1)、基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)在椎間盤退變中起關鍵作用[3];另一方面，細胞外信號調節(jié)蛋白激酶 (Extracellular signal regulated protein kinase，ERK1/2)可促進細胞增殖信號的傳導，故激活ERK1/2信號通路可促進細胞增殖、分化及抑制細胞凋亡等[4]。此外，ERK1/2信號傳導通路的激活往往可伴有另一通路PI3K-Akt信號通路的激活[5]。蛋白激酶 B(Protein kinaseB，Akt)在細胞存活和凋亡中起重要作用，故Akt、ERK1/2可對椎間盤纖維環(huán)細胞的生長修復及凋亡有重要影響。對頸椎病的治療西醫(yī)主要有手術治療和西藥的抗炎鎮(zhèn)痛治療，但手術影響頸椎結構穩(wěn)定性，且費用高、創(chuàng)傷大、西藥治療副作用多等因素，傳統(tǒng)中醫(yī)療法治療頸椎病療效公認，捏脊療法治療該病顯示出較好療效[6]。本文研究捏脊療法對頸椎間盤纖維環(huán)細胞影響及其機制具有重要意義。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

SPF級SD大鼠24只，體質量(180±10)g，雌雄各半，按隨機數字表法分成空白組、模型組、捏脊組、莫比可組，每組6只。動物由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器

一抗(MMP-1、MMP-3、ERK1/2、Akt抗體)試劑盒、免疫組化SABC試劑盒(內含二抗試劑盒、DAB顯色劑、APES防脫片試劑)，以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司，美洛昔康片，購自揚子江藥業(yè)集團有限公司(批號H12030241)，切片機、恒溫干燥箱、石蠟包埋機。

2 方法

2.1 實驗造模

建立動靜力失衡頸椎病模型，依據王擁軍等[7]實驗造模。模型組大鼠稱重腹腔麻醉后，在大鼠右側耳后項背部將鼠毛剔除，常規(guī)消毒，然后在大鼠項背部正中縱向切開長度2 cm左右的切口，再將深群頸夾肌和頭、頸、寰最長肌橫向切斷，切除頸髂肋肌與頭半棘肌，再依次切除右棘上和棘間韌帶，最后縫合。捏脊組、莫比可組造模方法同模型組?？瞻捉M僅消毒切開皮膚后縫合。造模后同等條件、相同時間下飼養(yǎng)2個月。通過HE染色，光學顯微鏡下觀察椎間盤組織形態(tài)學情況:空白組頸椎間盤的髓核四周環(huán)繞著纖維環(huán)組織且緊密排列，界限清楚;纖維環(huán)軟骨結構清晰可辨，軟骨細胞排列整齊，未見炎性細胞浸潤。模型組髓核出現皺縮，髓核與纖維環(huán)間的界限較模糊，髓核有外突趨勢，纖維環(huán)軟骨層纖維部分出現腫脹甚至斷裂，膠原纖維毛糙，軟骨細胞有退行性改變[8]，確定造模成功。

2.2 治療方法

捏脊組造模后將大鼠用自制的松緊帶固定，每日進行1次捏脊治療。捏脊手法:一手固定大鼠，另一手的拇指與食指指腹相對用力，輕輕提起大鼠脊柱兩側皮膚，從脊中線尾根部一直捏至大椎穴處1次共14次。從第7次開始雙手十指齊捏脊柱兩側皮膚并捏三提一，從尾根部至大椎穴，力量以大鼠不尖叫且較平靜為度。操作中涉及的穴位按《實驗針灸學》(李忠仁主編，中國中醫(yī)藥出版社出版)比照人體穴位選取[9]。每日1次，連續(xù)14 d為1個療程，間隔2 d后開始下個療程，共2個療程。

莫比可組造模固定后給予莫比可灌胃治療，按照《動物實驗方法學》[10]人與大鼠體表面積的藥物等效劑量換算為:大鼠的劑量=人的劑量×(90/100)×(人的體質量/大鼠的體質量)1/3。每日1次，連續(xù)14 d為1個療程，療程同捏脊組?？瞻捉M、模型組大鼠均固定而不做其他任何處理，治療時間及療程同捏脊組。

2.3 免疫組化檢測

將SD大鼠麻醉處死后于冰袋上快速依次取下各節(jié)椎間盤軟骨組織，用PBS清洗2遍，放入4%多聚甲醛液固定、脫鈣、脫水、石蠟包埋后進行免疫組化操作:先脫蠟，常規(guī)處理至水，于3%H2O2室溫孵育8 min。在0.01 mol/L檸檬酸緩沖液中，微波爐加熱至沸騰后將組織放入悶10 min取出，室溫冷卻后用蒸餾水洗1次，PBS洗5 min×3次，再用BSA封閉10 min，稀釋一抗，4℃過夜，將組織取出室溫復溫1 h后，PBS洗3 min×3次，滴加生物素標記的二抗室溫孵育20 min，PBS洗5 min×3次;滴加試劑SABC20 min，PBS洗3 min×3次;DAB顯色液顯色5 min，顯微鏡下觀察。陽性細胞表達為棕黃色或棕褐色顆粒，每組隨機取5只大鼠，每只1張切片，每張切片取400倍視野5個，記錄其陽性表達細胞數取均值，最后蒸餾水洗，未復染，脫水、透明、封片。

2.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數據以均數±標準差(s)表示，各組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 頸椎間盤纖維環(huán)細胞MMP-1、MMP-3免疫組化的檢測結果

頸椎間盤纖維環(huán)細胞MMP-1染色結果顯示，空白組染色較淺，多呈弱陽性或陰性表達，陽性表達較少(見圖1);模型組大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞染色普遍較深，黃色、棕褐色較多見，多呈陽性表達(見圖2);捏脊組、莫比可組多呈陽性或弱陽性(見圖3、圖4)。MMP-3蛋白表達:在空白組陽性反應細胞數量較模型組明顯較少(見圖5、6);捏脊組、莫比可組陽性細胞數量均較模型組少(見圖7、8)。表1顯示，模型組MMP-1、MMP-3陽性細胞數明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);捏脊組與模型組比較，MMP-1、MMP-3蛋白陽性細胞數明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示捏脊療法可降低MMP-1、MMP-3蛋白表達。

表1 大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞MMP-1、MMP-3、ERK1/2、Akt蛋白表達結果(s)

表1 大鼠頸椎間盤纖維環(huán)細胞MMP-1、MMP-3、ERK1/2、Akt蛋白表達結果(s)

注:與模型組比較:△P ＜0.05

組別 例數MMP-1 MMP-3 ERK1/2 Akt空 白 組 6 24.17±5.23△ 15.50±6.8△ 65.83±14.95△ 96.00±17.02△模 型 組 6 53.3±12.11 49.33±6.64 34.83±11.25 65.50±16.54捏 脊 組 6 26.33±4.89△ 16.17±5.67△ 56.50±18.44△ 88.33±15.77△莫 比 可 組 6 25.33±8.82△ 16.83±6.85△ 58.33±23.54△ 89.67±20.49△

圖1 空白組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(MMP-1的免疫組化表達，×400)

圖2 模型組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(MMP-1的免疫組化表達，×400)

圖3 捏脊組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(MMP-1的免疫組化表達，×400)

圖4 莫比可組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(MMP-1的免疫組化表達，×400)

圖5 空白組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(MMP-3的免疫組化表達，×400)

圖6 模型組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(MMP-3的免疫組化表達，×400)

圖7 捏脊組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(MMP-3的免疫組化表達，×400)

圖8 莫比可組模型組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(MMP-3的免疫組化表達，×400)

圖9 空白組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(ERK1/2的免疫組化表達，×400)

圖10 模型組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(ERK1/2的免疫組化表達，×400)

圖11 捏脊組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(ERK1/2的免疫組化表達，×400)

圖12 莫比可組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(ERK1/2的免疫組化表達，×400)

圖13 空白組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(Akt的免疫組化表達，×400)

圖14 模型組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(Akt的免疫組化表達，×400)

圖15 捏脊組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(Akt的免疫組化表達，×400)

3.2 纖維環(huán)細胞ERK1/2、Akt的免疫組化檢測結果

ERK1/2、AKT蛋白表達結果表明，空白組大鼠纖維環(huán)細胞均有較多的ERK1/2、Akt蛋白表達，且顏色較深，多呈強陽性(見圖9、圖13);模型組大鼠纖維環(huán)細胞顏色較淺，ERK1/2、Akt蛋白表達較少(見圖10、圖14)。捏脊組、莫比可組多呈弱陽性、陽性(見圖 11、圖12、圖15、16)。圖像分析結果(見表1)，與空白組比較，模型組ERK1/2、Akt陽性細胞數顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型組比較，捏脊組ERK1/2、AKT陽性細胞數有顯著提高(P＜0.05)，提示捏脊能夠促進大鼠纖維環(huán)細胞ERK1/2、AKT的蛋白表達。

圖16 莫比可組頸椎間盤纖維環(huán)細胞(Akt的免疫組化表達，×400)

4 討論

4.1 頸椎病與捏脊療法

頸椎病屬于中醫(yī)學“痹證”范疇，頸項部為主要發(fā)病部位。從經絡角度來說，頸椎病發(fā)生與督脈、膀胱經關系密切。《靈樞·經脈》曰:“督脈之別，名曰長強，挾膂上項，散頭上，下當肩胛左右，別走太陽，入貫膂?！倍矫}為“陽脈之海”，總督諸陽，頭為諸陽之會，頸項背部屬陽，足太陽膀胱經又與督脈旁通，五臟六腑的背俞穴均在膀胱經上，二經共主諸陽，故督脈與手足三陽經及頸項、臟腑經脈氣血有密切聯系。因此二經可運行氣血精髓，上可傳輸于腦，下可濡養(yǎng)經脈所過之皮肉筋骨等部位;若二經經氣虛無力升陽，氣血精髓不能上達頸腦部，即導致頸項部肌肉筋骨腦髓失養(yǎng)，故此二經在維持頸項部正常功能有關鍵作用?，F代研究表明，捏脊療法既可疏調督脈、振奮陽氣，又可刺激膀胱經背部腧穴，以協(xié)調臟腑功能，使機體達到氣血通暢[11]，故捏脊療法可作為通調二經治療頸椎病的重要方法。

4.2 細胞外基質降解與基質金屬蛋白酶關系

在椎間盤中細胞外基質占絕大部分，研究表明細胞外基質的降解可直接導致椎間盤力學特征喪失，進而加速椎間盤退變。Ⅰ、Ⅱ型膠原是椎間盤組織中主要的細胞外基質成分之一。MMP-1在Ⅱ型膠原降解中起關鍵的作用，而且其他許多MMPs對Ⅱ型膠原的降解均需通過它起作用。MMP-3不僅能分解聚集性蛋白多糖，也能裂解膠原，激活其他基質金屬蛋白酶降解基質，是細胞外基質降解的關鍵酶[12]。本實驗模型組椎間盤纖維環(huán)MMP-1、MMP-3的表達明顯高于空白組，證實MMP-1、MMP-3均參與破壞椎間盤組織結構過程，從而導致椎間盤的退變。

4.3 纖維環(huán)細胞凋亡與Akt、ERK1/2

頸椎間盤退變的主要發(fā)病因素是軟骨細胞的凋亡[13]。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)是整合素介導信號傳導通路的中心分子，是多種信號通路的上游分子，通過ERK將細胞外信號最終傳遞至胞核，可調控細胞增殖、凋亡、黏附等生物學行為。研究表明，Integrin/FAK信號通路在椎間盤細胞凋亡中具有重要調節(jié)作用，激活Integrin/FAK信號通路可激活 ERK1/2，即激活通路 FAK-Ras-MAPK，MAPK信號通路對細胞的生長與凋亡具有重要調節(jié)作用，廣泛存在于各種細胞中[14]。ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員之一，其被激活后，通過磷酸化可抗凋亡分子、激活轉錄因子而達到抗凋亡促進軟骨細胞生長作用[4]。此外研究發(fā)現，ERK1/2信號傳導通路的激活可誘導PI-3K被激活，進而通過Akt磷酸化一系列下游底物[5]，其中Akt是絲氨酸/酪氨酸家族成員之一，可促進軟骨細胞Ⅱ型膠原的分泌，從而抑制軟骨退變、減緩細胞凋亡。

本實驗結果顯示，捏脊療法能降低纖維環(huán)細胞中MMP-1、MMP-3的表達及提高大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞中Akt、ERK1/2的含量以控制椎間盤退變。而MMP-1、MMP-3的表達減少很可能與細胞外基質Ⅱ型膠原分解密切相關;同時Akt、ERK1/2含量的提高是否是通過信號通路 PI-3K-Akt、FAK-Ras-MAPK或其他相關通路的磷酸化來實現，還需進一步研究證實。

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