梁冰，牛立志，曾健瀅，周亮，周序瓏，方剛，姚飛，鄧春娟，汪媛，張波，李書英，鄧春梅，楊惠霏，李家亮，劉建國，徐克成

·實(shí)驗(yàn)研究Experimental research·

不可逆電穿孔消融兔膽囊側(cè)肝臟病理學(xué)觀察

梁冰，牛立志，曾健瀅，周亮，周序瓏，方剛，姚飛，鄧春娟，汪媛，張波，李書英，鄧春梅，楊惠霏，李家亮，劉建國，徐克成

目的研究靠近膽囊0.5 cm處不可逆電穿孔肝臟消融的安全性和有效性。方法采用新西蘭白兔3只作為實(shí)驗(yàn)動物，在靠近膽囊0.5 cm處肝臟進(jìn)行不可逆電穿孔消融，并于7 d后觀察消融區(qū)域的肝臟病理反應(yīng)和膽囊損傷情況。結(jié)果3只動物均成功完成消融。消融7 d后，肝臟面原消融區(qū)平均直徑3.00 cm黃色壞死灶，肝膈面形成1個平均直徑1.67 cm類圓形黃色壞死灶。2只實(shí)驗(yàn)兔消融部位和腹壁、1只肝葉和膈肌發(fā)生小片段淺度粘連。2只腸系膜則與膽囊消融灶區(qū)發(fā)生嚴(yán)重粘連。光鏡下可見肝大片壞死且消失，僅有部分凝固性壞死肝組織殘留，外圍有少量斑點(diǎn)狀鈣化，炎性肉芽組織和小膽管顯著增生。肝門靜脈血管平滑肌損傷不明顯，肌層小范圍纖維素樣變性、膽囊黏膜上皮大部分壞死，膽囊外結(jié)締組織水腫、膽總管部分黏膜上皮壞死，部分上皮仍存在，肌層完好。結(jié)論消融部位肝臟組織完全壞死，消融灶和周圍組織分界明顯，膽囊出現(xiàn)損傷，但無膽囊漏發(fā)生。因此，對于靠近膽囊的肝臟腫瘤而言，不可逆電穿孔可能是一種相對安全有效的選擇。

肝臟；不可逆電穿孔消融；膽囊；兔

我國是原發(fā)性肝癌的高發(fā)國家，病死率占惡性腫瘤的第2位［1］。腫瘤手術(shù)切除是目前肝癌患者獲得長期生存乃至根治的主要方法之一，但能獲得手術(shù)切除的患者低于20%。對于不可切除的肝癌，化療已成為最主要的治療手段，但由于可能的不良反應(yīng)，化療的療效仍然有限。近年來，微創(chuàng)外科和腫瘤局部治療的興起為肝癌的治療開辟了新的方向。目前，射頻消融［2］、微波消融［3］、冷凍消融［4］和不可逆電穿孔［5］都已成功用于治療肝癌。其中，不可逆電穿孔是最近剛開始在臨床應(yīng)用的腫瘤消融新技術(shù)，該技術(shù)利用高壓直流電發(fā)出的強(qiáng)大電場的作用，在細(xì)胞膜上產(chǎn)生多個細(xì)孔從而不可逆轉(zhuǎn)地破壞細(xì)胞，導(dǎo)致即時腫瘤細(xì)胞死亡［6-7］。由于消融產(chǎn)生在細(xì)胞膜上的細(xì)孔為納米級別的空洞，該技術(shù)又被稱為納米刀。對于肝臟腫瘤消融，對靠近隔膜穹頂?shù)谝桓伍T和鄰近膽囊部位的腫瘤進(jìn)行消融，由于可能會引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，一直是經(jīng)皮穿刺消融肝臟腫瘤的難點(diǎn)甚至是禁忌［8］。由于不可逆電穿孔具有消融范圍明確、消融時間短、對神經(jīng)和血管具有保護(hù)作用的優(yōu)點(diǎn)，在肝臟肝門和膽囊等關(guān)鍵部位的消融可能具有一定優(yōu)勢。因此，本研究在白兔肝臟靠近膽囊0.5 cm處進(jìn)行不可逆電穿孔消融，觀察消融7 d后肝臟情況和膽囊的病理損傷，以探討不可逆電穿孔對于靠近膽囊的肝臟消融的有效性和安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物雌性普通級新西蘭兔3只，體重2.5～30 kg，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號［SCXK（粵）2011-0015］，動物合格證號［粵監(jiān)證字44002100000654］。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)器械和藥品試劑AngioDynamics納米刀系統(tǒng)（美國AngioDynamics公司），包括主機(jī)、長15 cm和有效距離0～4 cm的納米刀電探針（美國AngioDynamics公司，批號20400104）；監(jiān)護(hù)儀（荷蘭Philips公司，型號M8001A），ID3.0氣管導(dǎo)管購自泰科醫(yī)療器材國際貿(mào)易（上海）有限公司（批號為11004113042）、ENT-1001嬰兒型呼吸囊購自臺灣-彥大有限公司（批號為20100426）、阿托品購自天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司（批號為715765U），鹽酸氯胺酮注射液購至福建古田藥業(yè)有限公司（批號為H35020148）。鹽酸戊己奎醚（長托寧）注射液購至城都力思特制藥（批號為120607）公司，維庫溴銨粉針劑購自浙江仙琚藥業(yè)（批號為130303），硫酸阿托品注射液購自徐州萊恩藥業(yè)（批號為1211112），新斯的明注射液購自上海信誼金朱藥業(yè)（批號120802）。

1.2 方法

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉動物禁食24 h，禁水12 h。術(shù)前在實(shí)驗(yàn)兔腿部肌內(nèi)注射阿托品（0.02mg/kg）及鹽酸氯胺酮注射液（44 mg/kg）誘導(dǎo)麻醉后，家兔仰臥位固定，在劍骨突后緣至恥骨前緣備皮，行氣管切開后置入ID 3.0號氣管導(dǎo)管，肌內(nèi)注射維庫溴銨0.12mg/kg。選用嬰兒型呼吸囊控制呼吸，控制潮氣量為50 ml，呼吸頻率為30～50次/min，呼吸比為1∶1和氧分壓為100%。開腹前按體重44mg/kg后腿肌肉注射氯胺酮注射液以維持麻醉。手術(shù)結(jié)束，自肌內(nèi)注射維庫溴銨30min后給予阿托品、新斯的明各0.1 mg拮抗肌肉松弛，30 min重復(fù)1次。

1.2.2 納米刀消融步驟動物麻醉后開腹，暴露肝左上葉，直視下將納米刀電探針1（P+）和探針2（P-）垂直插入肝臟面0.5 cm，2針距離1.5 cm，使與膽囊壁距離為0.5 cm，設(shè)置探針有效距離為0.5 cm，起始電壓為2 250 V、脈沖長度70 ms和數(shù)字脈沖90 Hz后啟動系統(tǒng)，消融術(shù)程約1 min，電擊結(jié)束后拔出探針即完成納米刀消融術(shù)。于消融區(qū)兩端各置一縫線作為標(biāo)記后結(jié)束手術(shù)，將臟器回納腹腔，常規(guī)閉腹，待實(shí)驗(yàn)動物蘇醒后自由飲食，護(hù)理期間不給予藥物。

1.2.3 術(shù)中與術(shù)后觀察術(shù)中觀察電消融時肝臟及膽囊表面形態(tài)變化，用游標(biāo)卡尺測量并記錄組織表面消融區(qū)域最大半徑。術(shù)后第7天對實(shí)驗(yàn)兔實(shí)行安樂死，觀察肝臟與膽囊消融區(qū)域及周邊臟器形態(tài)變化。

1.2.4 病理檢查取組織標(biāo)本置甲醛中固定24 h以上，石蠟包埋，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，連續(xù)切片，厚度5μm，常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，封片后鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 5（GraphPad，USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x± s）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)中與術(shù)后消融區(qū)形態(tài)觀察

2.1.1 術(shù)中肝臟及膽囊形態(tài)變化消融過程中未見肝臟和膽囊表面有顯著外觀改變（圖1a），消融結(jié)束后肝消融區(qū)顏色略深，邊緣不清晰，穿刺部位有少量出血，周圍組織形態(tài)及顏色無異常（圖1b）。

2.1.2 術(shù)后消融區(qū)域及周邊臟器形態(tài)變化消融7 d后肝膈面原消融區(qū)可見一8字型黃色壞死灶，表面最大徑平均為3.00 cm，外周有一圈淡粉紅色的分隔帶，與周圍組織分界明顯（圖1c）；肝臟面形成一類圓形黃色壞死灶（圖1d），表面最大徑平均為1.67 cm。將壞死灶以術(shù)中消融區(qū)兩端縫線作連線，垂直肝葉剖開后，可見壞死灶全層貫穿左肝葉，其他區(qū)域肝臟組織未見異常?？拷蜗趨^(qū)一側(cè)膽囊壁顏色變淺，發(fā)白。

圖1 不可逆電穿孔肝臟消融過程

2.1.3 粘連情況2只實(shí)驗(yàn)兔腹壁、1只肝葉和膈肌與肝膈面消融區(qū)發(fā)生小片段淺度粘連。2只腸系膜則與膽囊消融灶區(qū)發(fā)生嚴(yán)重粘連。

2.2 病理組織學(xué)觀察

2.2.2 肝消融區(qū)7 d后組織學(xué)觀察光鏡下可見肝組織大片壞死消失，僅有部分凝固性壞死肝組織輪廓?dú)埩?，外圍有少量斑點(diǎn)狀鈣化，炎性肉芽組織和殘留小膽管顯著增生（圖2）。

圖2 兔肝臟消融7 d后組織學(xué)所見（HE，×400）

2.2.3 肝門靜脈、膽囊和膽總管消融7 d后組織學(xué)觀察①肝門靜脈血管平滑肌損傷不明顯，肌層損傷不理想，小范圍纖維素樣變性（圖3a）。②膽囊黏膜層上皮大部分壞死脫落，小部分仍存在，肌層損傷不明顯，膽囊漿膜層充血水腫，少量炎細(xì)胞浸潤（圖3b）。③膽總管部分黏膜上皮壞死，部分上皮仍存在，漿膜層充血水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤（圖3c）。

3 討論

不可逆電穿孔是2012年4月美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的腫瘤消融新技術(shù)。該技術(shù)具有以下特點(diǎn)：①不可逆電穿孔可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引發(fā)腫瘤組織壞死［9-11］。②與已有的熱消融技術(shù)如射頻消融、微波消融和冷凍消融不同，不可逆電穿孔無需熱能，通過改變細(xì)胞膜通透性即可導(dǎo)致組織死亡。因此，該法不受熱沉效應(yīng)影響。③不可逆電穿孔可在消融區(qū)和非消融區(qū)產(chǎn)生明顯的邊界，這將最大可能的減少對腫瘤組織的損傷，減少并發(fā)癥的發(fā)生。④消融時間短。與傳統(tǒng)消融技術(shù)（30min～數(shù)小時）相比，不可逆電穿孔可在微秒到毫秒治療時間內(nèi)有效導(dǎo)致組織死亡。非熱細(xì)胞死亡及治療時間顯著減少。⑤對神經(jīng)和大血管的保護(hù)作用［12-15］。這使不可逆電穿孔可以在富含大血管或神經(jīng)的部位消融腫瘤，而不用擔(dān)心并發(fā)癥的發(fā)生。因此，由于不可逆電穿孔的上述優(yōu)勢，該方法已在肝癌消融方面進(jìn)行了初步的臨床應(yīng)用，并顯示出非常廣闊的應(yīng)用前景［16-17］。

圖3 膽囊、肝門靜脈、膽囊消融7 d后病理學(xué)觀察（HE，×40）

由于肝臟組織血供較為豐富，局部微環(huán)境差異較大，不同的消融程序?qū)τ谙谛Ч绊戄^大。由于不可逆電穿孔沒有“熱沉”效應(yīng)，該技術(shù)在治療接近血管的腫瘤上獨(dú)具優(yōu)勢［18］。但是，由于不可逆電穿孔的研究尚處于初級階段，其消融肝臟腫瘤的適應(yīng)證和禁忌證尚未深入研究。對于不可逆電穿孔來說，靠近膈膜穹頂，第一肝門和鄰近膽囊部位的腫瘤消融，也可能會引發(fā)膈肌穿孔或膽囊漏發(fā)生，需要對其進(jìn)行深入系統(tǒng)研究。本研究利用新西蘭白兔模型，在白兔肝臟靠近膽囊處0.5 cm處進(jìn)行不可逆電穿孔消融，觀察7 d后肝臟的消融情況和膽囊的病理損傷，以探討不可逆電穿孔對于靠近膽囊的肝臟消融的有效性和安全性。本次研究發(fā)現(xiàn)，消融7 d后肝臟面原消融區(qū)3.00 cm黃色壞死灶，肝膈面形成1個1.67 cm類圓形黃色壞死灶。外周有一圈淡粉紅色的分隔帶，與周圍組織分界明顯。2只實(shí)驗(yàn)兔消融部位和腹壁、1只肝葉和膈肌發(fā)生小片段淺度粘連。光鏡下可見肝大片壞死且消失，僅有部分凝固性壞死肝組織殘留，外圍有少量斑點(diǎn)狀鈣化，炎性肉芽組織和小膽管顯著增生。肝門靜脈血管平滑肌損傷不明顯，肌層小范圍纖維素樣變性、膽囊黏膜上皮大部分壞死，膽囊外結(jié)締組織水腫、膽總管部分黏膜上皮壞死，部分上皮仍存在，肌層完好。2只兔腸系膜則與膽囊消融灶區(qū)發(fā)生嚴(yán)重粘連。因此，從目前的結(jié)果來看，不可逆電穿孔靠近膽囊0.5 cm消融肝臟，肝臟組織壞死明確，膽囊出現(xiàn)明確損傷，但沒有膽囊漏發(fā)生。

總之，本研究對肝臟靠近膽囊0.5 cm處進(jìn)行不可逆電穿孔消融，以觀察該方法在臨床上靠近膽囊的肝臟腫瘤消融的安全性和有效性。結(jié)果顯示，消融部位肝臟組織完全壞死，消融灶和周圍組織分界明顯，膽囊出現(xiàn)損傷，但沒有膽囊漏發(fā)生。因此，對于靠近膽囊的肝臟腫瘤來說，不可逆電穿孔可能是一種相對安全有效的選擇。還需要對該技術(shù)作進(jìn)一步研究，以在治療時正確選擇患者，減少潛在并發(fā)癥的發(fā)生，從而明確不可逆電穿孔的適應(yīng)范圍和臨床應(yīng)用價值。

［1］Jemal A，Murray T，Ward E，etal.Cancer statistics，2005［J］. CA Cancer JClin，2005，55：10-30.

［2］Cucchetti A，Piscaglia F，Cescon M，et al.Systematic review of surgical resection vs radiofrequency ablation for hepatocellular carcinoma［J］.World JGastroenterol，2013，19：4106-4118.

［3］Itoh S，Ikeda Y，Kawanaka H，et al.Efficacy of surgical microwave therapy in patients with unresectable hepatocellular carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2011，18：3650-3656.

［4］Mu F，Niu L，Li H，et al.Percutaneous comprehensive cryoablation formetastatic hepatocellular cancer［J］.Cryobiology，2013，66：76-80.

［5］Cheung W，Kavnoudias H，Roberts S，et al.Irreversible electroporation for unresectable hepatocellular carcinoma：initial experience and review of safety and outcomes［J］.Technol Cancer Res Treat，2013，12：233-241.

［6］Long G，Bakos G，Shires PK，et al.Histological and finite element analysis of cell death due to irreversible electroporation［J］.Technol Cancer Res Treat，2013：［Epub ahead of print］.

［7］Lee EW，Loh CT，Kee ST.Imaging guided percutaneous irreversible electroporation：ultrasound and immunohistological correlation［J］.Technol Cancer Res Treat，2007，6：287-294.

［8］Wu B，Xiao YY，Zhang X，et al.Magnetic resonance imagingguided percutaneous cryoablation of hepatocellular carcinoma in special regions［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2010，9：384-392.

［9］Xiao D，Yao C，Liu H，et al.Irreversible electroporation andapoptosis in human liver Cancer cells induced by nanosecond electric pulses［J］.Bioelectromagnetics，2013，34：512-520.

［10］Lee YJ，Lu DS，Osuagwu F，et al.Irreversible electroporation in porcine liver：acute computed tomography appearance of ablation zone with histopathologic correlation［J］.J Comput Assist Tomogr，2013，37：154-158.

［11］Schmidt CR，Shires P，Mootoo M.Real-time ultrasound imaging of irreversible electroporation in a porcine livermodel adequately characterizes the zone of cellular necrosis［J］.HPB（Oxford），2012，14：98-102.

［12］Li W，F(xiàn)an Q，Ji Z，et al.The effects of irreversible electroporation（IRE）on nerves［J］.PLoS One，2011，6：e18831.

［13］Maor E，Ivorra A，Leor J，et al.The effect of irreversible electroporation on blood vessels［J］.Technol Cancer Res Treat，2007，6：307-312.

［14］Lee YJ，Lu DS，Osuagwu F，et al.Irreversible electroporation in porcine liver：short-and long-term effect on the hepatic veins and adjacent tissue by CT with pathological correlation［J］.Invest Radiol，2012，47：671-675.

［15］Kingham TP，Karkar AM，D’angelica MI，et al.Ablation of perivascular hepatic malignant tumors with irreversible electroporation［J］.JAm Coll Surg，2012，215：379-387.

［16］Charpentier KP.Irreversible electroporation for the ablation of liver tumors：are we there yet？［J］.Arch Surg，2012，147：1053-1061.

［17］Narayanan G.Irreversible electroporation for treatment of liver Cancer［J］.Gastroenterol Hepatol（N Y），2011，7：313-316.

［18］Cannon R，Ellis S，Hayes D，et al.Safety and early efficacy of irreversible electroporation for hepatic tumors in proximity to vital structures［J］.JSurg Oncol，2013，107：544-549.

Irreversible electroporation ab lation of the hepatic region close to the gallbladder：pathological

observation in experimental rabbits

LIANG Bing，NIU Li-zhi，ZENG Jian-ying，ZHOU Liang，ZHOU

Xu-long，F(xiàn)ANG Gang，YAO Fei，DENG Chun-juan，WANG Yuan，ZHANG Bo，LI Shu-ying，DENG Chun-mei，YANG Hui-fei，LI Jia-liang，LIU Jian-guo，XU Ke-cheng.Affiliated Fuda Cancer Hospital，School of Medicine，Ji’nan University，Guangzhou，Guangdong Province 510665，China

XU Ke-cheng，E-mail：fudalab@gmail.com

ObjectiveTo investigate the safety and efficacy of irreversible electroporation（IRE）ablation of hepatic region close（0.5 cm）to the gallbladder.MethodsThree New Zealand white rabbitswere used for this study.The IRE probes，which were p laced in the hepatic tissue，were 0.5 cm apart from the gallbladder，and IRE ablation was performed.Seven days after the treatment the pathological changes of the hepatic ablated zones and gallbladderswere exam ined.ResultsSuccessful IRE ablation was accomp lished in all 3 rabbits.Seven days after the treatment the experimental rabbits were sacrificed，and their livers and gallbladders were collected and sent for pathological examination.Macroscopically，the hepatic surface of the ablated area showed a yellow necrotic lesion，which was（3.00±0.50）cm in size.At the diaphragmatic surface of the liver a round yellow lesion was seen with a size about（1.67±1.15）cm.Slight superficial adhesion could be seen at the ablated areas and abdom inal wall（n=2），hepatic lobe（n=1）and diaphragm（n=1）.Serious adhesion ofmesentery with the ablated gallbladderwas seen in two rabbits.Microscopically，massive necrosis or disappearance of the hepatic tissue together with a little residual hepatic coagulation necrosis and speckled calcifications at the peripheral region could be detected.Inflammatory granulation and prom inent proliferation of the tiny biliary ductswere also observed.The damage of the vascular smoothmuscle in the portal vein was not obvious.Small area of fibrinoid degeneration was seen in the muscular layer.Mucosal epithelial necrosis of the gallbladder and connective tissue edema outside the gallbladder could also be observed. Conclusion Complete necrosis of the hepatictissue at the ablated area can be achieved by IRE ablation.The ablated zone has a clear demarcation with the surrounding tissue.No gallbladder leakage occurs although the gallbladder is damaged.Therefore，for the hepatic tumors，which are located close to the gallbladder，irreversible electroporation ablation may be regarded as a relatively safe and effective treatment.（JIntervent Radiol，2014，23：320-324）

liver；irreversible electroporation ablation；gallbladder；rabbit

R735.7

B

1008-794X（2014）-04-0320-05

2013-12-20）

（本文編輯：侯虹魯）

廣州天河區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013KW 051）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.04.012

510665廣州暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬復(fù)大腫瘤醫(yī)院

徐克成E-mail：fudalab@gmail.com