何永志，嚴(yán)治學(xué)，Ernestina Amponsem，任曉亮，常艷旭

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193)

決明子是一味眾所周知的具有潤(rùn)腸通便功能的中藥［1］，具有調(diào)節(jié)血液和膽固醇作用，可用于治療高血壓、糖尿病、月經(jīng)不調(diào)、水腫等疾病。望江南在中國(guó)稱(chēng)為草決明，在中國(guó)南方局部地區(qū)用于腸道和皮膚等病的治療［2］。而在加納，草決明則用于治療高血壓、瘧疾、傷寒、咳嗽等疾?。?，4］?，F(xiàn)代研究表明，草決明含有多種化學(xué)成分，如蒽醌類(lèi)(番瀉葉苷A，B和C，蘆薈大黃素，大黃酚，大黃素，大黃酸等)，三萜類(lèi)、鞣質(zhì)、黃酮類(lèi)、油脂、毒白蛋白素和多糖等［5］。有學(xué)者對(duì)源自湖北省和南京市的草決明的蒽醌含量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)湖北省的草決明蒽醌含量最高，且炮制時(shí)間和溫度會(huì)影響揮發(fā)性成分的含量［6，7］，而在加納北方邦西部也出現(xiàn)過(guò)兒童因過(guò)量食用草決明而引起中毒的相關(guān)報(bào)道［8］。目前對(duì)于決明子質(zhì)量控制研究往往集中一個(gè)或幾個(gè)成分的定性或定量分析，或采用雙波長(zhǎng)HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量分析法鑒別炒決明子、生決明子和小決明子。而以多組分為基礎(chǔ)的測(cè)定草決明的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為控制藥材質(zhì)量，保證用藥安全，本文根據(jù)草決明所含化學(xué)成分特性，對(duì)來(lái)自加納和中國(guó)不同產(chǎn)地的22個(gè)草決明子樣本中五種蒽醌類(lèi)成分進(jìn)行含量測(cè)定，并建立HPLC指紋圖譜，為草決明的全面質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：島津(日本東京)二元LC－20AT泵，SIL20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO－10ASvp柱溫箱，SPD－20A紫外檢測(cè)器，CMB－20A系統(tǒng)控制器。

1.2 試藥：蘆薈大黃素(＞98.0%)，大黃酸(＞98%)，大黃素(＞99%)，大黃酚(＞99%)和大黃素甲醚(＞98.4%)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。草決明樣品產(chǎn)自加納11個(gè)不同地區(qū)以及中國(guó)兩個(gè)地區(qū)(武漢和南京)，并經(jīng)李天祥副教授鑒定，標(biāo)本保存于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本部(見(jiàn)表1)。乙腈和甲醇(色譜純)購(gòu)自天津江天化工有限公司;甲酸(分析純)購(gòu)自天津柯偉有限公司。純凈水購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

表1 草決明樣品

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：采用 Hypersil C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm，P.R)，流動(dòng)相：0.05%甲酸(A)－乙腈(B)，梯度洗脫：0-50min，5%B-90%B;流速 1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 254nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。生品(NR)、炒品(R)和5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品混合物HPLC色譜圖如圖1所示。

2.2 溶液的制備：標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：取蘆薈大黃素(1mg)、大黃酸(1mg)、大黃素(1mg)、大黃酚(1mg)和大黃素甲醚(5mg)精密稱(chēng)定，分別置于10mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別為100μg/mL、100μg/mL、100μg/mL、100μg/mL、100μg/mL、500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。樣品溶液的制備：采用傳統(tǒng)炒制法進(jìn)行炮制，在預(yù)熱的平底鍋(170－190℃)中將80g草決明種子煨炒4min，粉碎，過(guò)4號(hào)篩。取草決明粉末樣品(0.2g)精密稱(chēng)定，置10mL容量瓶中加甲醇/水(4∶1)10mL。記錄容量瓶質(zhì)量，室溫下將混合物超聲萃取40min，補(bǔ)足失重。提取液經(jīng)微孔濾膜(0.45m)過(guò)濾，取續(xù)濾液，待用。

圖1 生品(NR)、炒品(R)和5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品混合物

2.3 方法驗(yàn)證：精密量取5個(gè)蒽醌類(lèi)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，混合均勻，并逐級(jí)稀釋繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用最小二乘法對(duì)每個(gè)蒽醌類(lèi)化合物進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，結(jié)果表明線(xiàn)性范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好(R2＞0.996)。精密度由同一天同一樣品重復(fù)進(jìn)樣6次測(cè)定，峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)分別小于2.5%和0.1%(表3)。重復(fù)性通過(guò)分析6個(gè)平行制備的樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。穩(wěn)定性通過(guò)分析相同混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫下24h的含量進(jìn)行評(píng)價(jià)。加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表明，方法回收率介于95.6%-104.1%之間，RSD 小于6.2%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法驗(yàn)證結(jié)果 (RSD%)

2.4 含量測(cè)定：按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，經(jīng)微孔濾膜 (0.45μm)過(guò)濾，進(jìn)樣分析。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地樣品中蒽醌含量測(cè)定結(jié)果 (μg/mL)

2.5 草決明的HPLC指紋圖譜的建立：按“2.2”項(xiàng)下方法分別制備22個(gè)草決明藥材的樣品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析。比較各樣品色譜圖發(fā)現(xiàn)，不同樣品具有相似的化學(xué)成分，在HPLC指紋圖譜中，指認(rèn)了5個(gè)色譜峰：①蘆薈大黃素，②大黃酸，③大黃素，④大黃酚和⑤大黃素甲醚，保留時(shí)間分別為31.7，32.5，38.1，43.7，46.7min。色譜峰 9 在色譜圖上響應(yīng)最高且保留時(shí)間適宜，因此選取作為參比峰。其中7個(gè)產(chǎn)自加納的生品均有相應(yīng)炮制品，分析生品(1組)和炮制品(兩組)色譜圖，除了產(chǎn)自Adum Banso和Ahinsan的樣品，每組5個(gè)樣品都顯示了大量共有色譜峰的存在，因此采用軟件進(jìn)行色譜峰匹配，結(jié)果5個(gè)生品樣品顯示有16個(gè)共有峰，5個(gè)炮制樣品顯示有8個(gè)共有峰。如圖2所示。

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004 A)”，對(duì)產(chǎn)自加納5個(gè)生品及與中國(guó)產(chǎn)生品進(jìn)行相似度判別，結(jié)果見(jiàn)表4、5。

表4 共有峰相對(duì)峰面積和保留時(shí)間及5個(gè)樣品的相似度

表5 加納和中國(guó)草決明生品指紋圖譜的相似性

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種對(duì)草決明中的多個(gè)蒽醌類(lèi)成分進(jìn)行質(zhì)量控制的簡(jiǎn)單可靠的HPLC法，同時(shí)建立的草決明指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，為該藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

3.1 色譜條件的優(yōu)化和提取方法的選擇：為全面反映草決明藥材HPLC信息，對(duì)提取溶劑和提取時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果表明采用甲醇水溶液提取效果較好，并通過(guò)L9(34)正交試驗(yàn)，考察甲醇/水在20∶80、50∶50、80∶20時(shí)超聲提取效果。同時(shí)對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，比較甲醇、乙腈、甲酸、磷酸和水以不同比例作為流動(dòng)相，結(jié)果表明乙腈比甲醇有更好分離效果;檢測(cè)波長(zhǎng)在254nm和278nm時(shí)具有相似的色譜圖，但278nm下大黃素甲醚響應(yīng)較弱，因此選取254nm作為檢測(cè)波長(zhǎng);流速為1mL/min時(shí)，50min內(nèi)具有良好分離效果。

3.2 指紋圖譜的應(yīng)用：產(chǎn)自O(shè)kponglo sonitra的炮制品在加納的11個(gè)樣品中蒽醌類(lèi)化合物含量最高。與產(chǎn)自土壤條件相似的Physic garden(KNUST)樣品相比，相似度可達(dá)0.955;與兩個(gè)產(chǎn)自中國(guó)的炮制品相比，相似系數(shù)分別為南京(0.215)、武漢(0.335)。表明產(chǎn)自?xún)蓚€(gè)國(guó)家的樣品具有顯著的差異。

3.3 生品和炮制品的使用的差別：比較生品和炮制品的色譜峰的差別，結(jié)果色譜圖上共有34個(gè)色譜峰。其中5個(gè)色譜峰為生品特有，但炒制后都消失。炒制后產(chǎn)生19個(gè)新的色譜峰，其它有8個(gè)色譜峰吸收增強(qiáng)，2個(gè)色譜峰吸收下降。推測(cè)新色譜峰可能是在炒制過(guò)程中經(jīng)氧化或分解產(chǎn)生。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.134-135.

［2］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典［M］.第2版.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006.3133-3134

［3］Chu C，Hao Z，Wei X，et al.2007.High－performance liquid chromatographicngerprint analysis for different origins of sea buckthorn berries［J］.Journal of Chromatography A，1154：250－259.

［4］Dalziel JM，1956.Useful plants of west tropical africa［M］.Crown Agents for Overseas Governments，London，179-183.

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