汪靈芝彭建新余美玲黃煥森

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510260；

2.廣東省中醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510120；

3.安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233004

辛伐他汀對(duì)肝癌細(xì)胞間縫隙連接功能的影響研究

汪靈芝1彭建新2余美玲3黃煥森1

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510260；

2.廣東省中醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510120；

3.安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 233004

背景與目的：肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中伴隨著細(xì)胞間縫隙連接(gap junction，GJ)功能的下降，恢復(fù)或增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞間的GJ可以抑制腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)增殖。本研究擬通過(guò)觀察辛伐他汀對(duì)肝癌細(xì)胞間GJ功能的影響，尋找能夠增強(qiáng)GJ功能的藥物，從而為肝癌的治療提供新策略和新手段。方法：采用磺酰羅丹明B法觀察辛伐他汀對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞Hep3b的抑制作用；細(xì)胞接種熒光法和劃痕標(biāo)記/染料示蹤技術(shù)觀察辛伐他汀對(duì)GJ功能的影響。結(jié)果：1、5和10 μmol/L辛伐他汀在24 h作用時(shí)間內(nèi)均對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，將不影響GJ的數(shù)量；取5、10 μmol/L辛伐他汀作用細(xì)胞4 h后，與對(duì)照組相比，GJ的熒光傳遞功能明顯增強(qiáng)；與對(duì)照組相比，5、10 μmol/L辛伐他汀作用細(xì)胞4 h后，熒光黃染料(lucifer yellow，Ly，Sigma)傳輸范圍隨著辛伐他汀濃度的升高逐漸增大。結(jié)論：辛伐他汀可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞GJ功能。

辛伐他??；縫隙連接；肝癌

原發(fā)性肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其死亡率在消化系統(tǒng)腫瘤中居第3位。90%以上的原發(fā)性肝癌是肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，全世界每年發(fā)病人數(shù)為25萬(wàn)，僅中國(guó)就有11萬(wàn)(44.7%)，且呈逐年上升趨勢(shì)。因此，攻克HCC已成為亟待解決的重大課題。他汀類藥物廣泛應(yīng)用于臨床治療高膽固醇血癥，近年來(lái)的研究表明，他汀類藥物除了有降血脂的作用，還能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其分化和凋亡［1］。細(xì)胞學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，包括辛伐他汀在內(nèi)的多種他汀類藥物能夠抑制人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2-3］。

細(xì)胞縫隙連接(gap junction，GJ)是細(xì)胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道，由連接蛋白組成，廣泛存在于實(shí)質(zhì)性臟器(如心臟、肝臟、腎臟、中樞神經(jīng)、皮膚和肌肉等)組織中，依據(jù)不同的相對(duì)分子質(zhì)量而命名［4］。多數(shù)腫瘤細(xì)胞在發(fā)生、生長(zhǎng)過(guò)程中，伴有GJ的下降或缺失；而恢復(fù)或增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞間的GJ可以抑制腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)增殖，有利于重建細(xì)胞正常的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，還能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性［5-6］。人體正常肝臟組織主要表達(dá)連接蛋白32和連接蛋白26。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中伴隨著細(xì)胞間由連接蛋白組成的GJ功能的下降，而通過(guò)藥物或者其他方法上調(diào)GJ功能能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化［7］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能夠增加睪丸癌細(xì)胞上連接蛋白43組成的GJ功能［8］，但辛伐他汀對(duì)由其他連接蛋白組成的GJ功能的影響仍未知。因此，本研究擬觀察辛伐他汀對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3b上GJ功能的影響，為尋找增強(qiáng)GJ功能的藥物和治療肝癌的新手段提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑

肝癌細(xì)胞Hep3b由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室提供；胎牛血清、青鏈霉素、胰酶和MEM干粉等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自Gibco公司；辛伐他汀購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人肝癌細(xì)胞Hep3b的培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞Hep3b培養(yǎng)于含10%胎牛血清和青鏈霉素的MEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，并通過(guò)0.25%胰蛋白酶消化法進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞培養(yǎng)24～48 h，使其表達(dá)形成有效的GJ。

1.2.2 磺酰羅丹明B法測(cè)定辛伐他汀的細(xì)胞毒性

磺酰羅丹明B是一種粉紅色的氨基甲氧雜蒽類化合物，在酸性環(huán)境下能與三氯醋酸固定后的細(xì)胞內(nèi)大分子上的堿性氨基酸結(jié)合，結(jié)合的染料的量在一定范圍內(nèi)線性地反映了蛋白質(zhì)的量，而蛋白質(zhì)的量是與細(xì)胞的數(shù)目呈正比的［9］。本實(shí)驗(yàn)取不同濃度(5和10 μmol/L)的辛伐他汀作用Hep3b細(xì)胞不同時(shí)間(24、48、72、96和120 h)后，每孔加入50 μL冰冷的50%三氯醋酸(終濃度為10%)于4 ℃固定。倒掉固定液，用超純水沖洗、干燥后，每孔加入0.4%磺酰羅丹明B，室溫染色30 min，用1%醋酸洗去游離染料，空氣干燥后，每孔精確加入150 μL的Tris (10 mmol/L)溶解染料，用酶標(biāo)儀在564 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，以只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照組調(diào)零。

1.2.3 細(xì)胞接種熒光示蹤法［10］檢測(cè)肝癌細(xì)胞Hep3b的GJ熒光傳遞功能

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1.0×105個(gè)/mL接種于6 孔板。隨機(jī)分為對(duì)照組、1 μmol/L辛伐他汀處理組、5 μmol/L辛伐他汀處理組和10 μmol/L辛伐他汀處理組。將表達(dá)有連接蛋白的細(xì)胞與熒光指示劑calcine-AM和DiI-CM共同溫育，使calcine-AM和DiI-CM進(jìn)入細(xì)胞，該細(xì)胞稱為“供體細(xì)胞”。將“供體細(xì)胞”接種到接受過(guò)不同處理并已生長(zhǎng)融合的肝癌細(xì)胞Hep3b(“接受細(xì)胞”)上，培養(yǎng)4 h。待形成穩(wěn)定的GJ后，用顯微熒光系統(tǒng)觀察，記錄GJ功能。小分子的calcine(發(fā)綠色熒光)可以通過(guò)GJ進(jìn)入相鄰的“接受細(xì)胞”；但大分子的DiI不能自由通過(guò)GJ而留在“供體細(xì)胞”內(nèi)，使之易于識(shí)別。計(jì)數(shù)一個(gè)“供體細(xì)胞”周圍含有calcine的“接受細(xì)胞”作為GJ功能指標(biāo)。

1.2.4 劃痕標(biāo)記/染料示蹤技術(shù)［6］檢測(cè)細(xì)胞GJ功能的變化

肝癌細(xì)胞Hep3b以1×105個(gè)/mL的濃度接種在直徑為35 mm的培養(yǎng)皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿含2 mL。待培養(yǎng)細(xì)胞融合到80%～90%時(shí)，將細(xì)胞分為對(duì)照組、5 μmol/L辛伐他汀處理組和10 μmol/ L辛伐他汀處理組。4 h后PBS沖洗培養(yǎng)皿3次，以除去細(xì)胞表面的雜質(zhì)，然后加入1 mL的熒光黃染料(lucifer yellow，Ly，Sigma，0.5 mg/mL)，用手術(shù)刀在培養(yǎng)皿表面作3道劃痕。室溫下靜置3 min后，吸除染料，再用PBS將游離的剩余熒光染料沖洗干凈。滴加少許PBS，以免在觀察過(guò)程中細(xì)胞變形、死亡。熒光倒置顯微鏡下觀察染料在劃痕垂直方向上的遷移距離。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。兩組之間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，組間比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)圖表采用Sigma Plot 10.0繪制。

2 結(jié) 果

2.1 辛伐他汀對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3b的抑制作用

為了排除辛伐他汀的細(xì)胞毒性對(duì)GJ功能的影響，我們首先用SRB法檢測(cè)不同濃度辛伐他汀對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3b生長(zhǎng)的影響，選擇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯毒性作用的辛伐他汀濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，1、5和10 μmol/L辛伐他汀在24 h時(shí)間內(nèi)均對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用；而5和10 μmol/L組在24 h后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用(P＜0.05)，1 μmol/L辛伐他汀在96 h后也對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有影響(表1)。

表1 辛伐他汀處理后肝癌細(xì)胞Hep3b的生存率Tab. 1 The viability of Hep3b cells treated with simvastatin

2.2 辛伐他汀增強(qiáng)肝癌hep3b細(xì)胞GJ功能

細(xì)胞接種熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，2.5、5和10 μmol/L辛伐他汀作用細(xì)胞4 h后肝癌Hep3b“供體細(xì)胞”周圍的熒光“接受細(xì)胞”數(shù)明顯增多，熒光傳遞分別增強(qiáng)了21%±2%、25%±3%和60%±4%。證明辛伐他汀可以增強(qiáng)由連接蛋白43所組成的GJ熒光傳遞功能(圖1)。

熒光劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組肝癌細(xì)胞Hep3b的Ly染料局限于劃痕兩側(cè)，無(wú)明顯的熒光染料傳輸現(xiàn)象，而細(xì)胞經(jīng)5和10 μmol/L辛伐他汀處理4 h后，肝癌細(xì)胞Hep3b的GJ功能有不同程度的增強(qiáng)，且隨辛伐他汀濃度的增高，Ly染料傳輸范圍也逐漸增大，這表明辛伐他汀有增強(qiáng)肝癌細(xì)胞Hep3b GJ功能的作用，并呈一定的劑量依賴關(guān)系(圖2)。

圖1 不同濃度辛伐他汀對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3b熒光傳遞功能的影響Fig. 1 The effect of simvastatin at concentrations on the dye spread of Hep3b cells through gap junctions assessed by parachute assay

圖2 辛伐他汀對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3b熒光傳遞功能的影響Fig. 2 The effect of simvastatin at concentrations on the dye spread of Hep3b cells through gap junctions assessed by scrape loading/dye transfer assay

3 討 論

大量的研究證實(shí)，與正常細(xì)胞相比，相應(yīng)的腫瘤組織伴隨著GJ功能的降低或消失；而恢復(fù)和上調(diào)腫瘤細(xì)胞的GJ功能可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7,11］。連接蛋白基因被公認(rèn)為是一種抑癌基因，而提高腫瘤細(xì)胞間GJ功能被認(rèn)為是腫瘤治療研究的新方向。肝癌的發(fā)生、發(fā)展伴隨著縫隙連接蛋白和連接蛋白32、連接蛋白43及組成的GJ功能的異常。研究發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，人肝癌細(xì)胞HuH7上連接蛋白43的表達(dá)增多引起連接蛋白32在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的聚集，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞HuH7上連接蛋白32所組成的GJ功能的降低［12］。研究還發(fā)現(xiàn)，全反式維甲酸RA能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞HepG2的GJ功能［13］。這些研究都表明GJ在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演重要的角色。采用藥物或者分子生物學(xué)方法改變GJ功能將為肝癌的治療提供新的思路。

本研究中劃痕標(biāo)記/染料示蹤技術(shù)結(jié)果顯示，對(duì)照組中肝癌細(xì)胞Hep3b間無(wú)明顯的熒光染料傳輸現(xiàn)象，證明肝癌細(xì)胞Hep3b間GJ功能本身較弱，而應(yīng)用辛伐他汀4 h后熒光染料傳輸現(xiàn)象明顯增強(qiáng)。辛伐他汀對(duì)肝癌細(xì)胞Hep3b的GJ的增強(qiáng)作用同樣也被細(xì)胞熒光接種實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，經(jīng)過(guò)10 μmol/L辛伐他汀處理后的細(xì)胞間熒光傳遞功能增強(qiáng)達(dá)60%。大量的臨床資料顯示，他汀類藥物確實(shí)能夠降低肝癌的發(fā)生和死亡率，機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果證明了辛伐他汀能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞間的GJ功能，將為他汀類藥物的抗癌機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。

GJ通道的開(kāi)啟及關(guān)閉受多種因素直接調(diào)控，如膜電位、pH值、Ca2+、連接蛋白的磷酸化、神經(jīng)體液因子、蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)因子以及外源性化學(xué)物質(zhì)等［4］。組成GJ的連接蛋白在細(xì)胞膜上的定位決定了其必定受到細(xì)胞膜物理特性的影響。像其他細(xì)胞膜上的蛋白通道一樣，GJ的結(jié)構(gòu)和功能受細(xì)胞膜上的脂質(zhì)(主要是磷脂和膽固醇)環(huán)境的影響。對(duì)細(xì)胞膜上分離出的GJ進(jìn)行分析，相比磷脂所占組分，其所含的膽固醇比例更高。研究表明，膽固醇不僅可以直接與蛋白質(zhì)結(jié)合，而且可以通過(guò)改變整個(gè)脂質(zhì)雙分子層的物理特性影響細(xì)胞膜上離子通道的結(jié)構(gòu)和功能［14］。Locke等［15］發(fā)現(xiàn)膽固醇和磷脂可以在體外改變由連接蛋白26或連接蛋白32組成的通道活性，外源性的補(bǔ)充膽固醇可以增加肝細(xì)胞GJ的組裝和通透性。Meyer等［16］的研究結(jié)果與其相仿。這些都表明，膽固醇可以參與調(diào)控GJ的結(jié)構(gòu)和功能。他汀類藥物是羥甲基戊二酸單酰(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG CoA)還原酶抑制劑藥物的總稱，這類藥物通過(guò)抑制HMG CoA還原酶的活性，阻斷膽固醇合成的甲羥戊酸途徑。辛伐他汀增強(qiáng)GJ功能是否與其對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成的影響有直接或者間接聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。另外，辛伐他汀還可以通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)甲羥戊酸途徑，影響下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵分子，如Ras、Rho、Rab和Rac等，進(jìn)而影響連接蛋白的合成與分布［17］。我們的前期研究還報(bào)道了辛伐他汀通過(guò)PKC磷酸化通路影響連接蛋白43的磷酸化，增強(qiáng)連接蛋白43組成的GJ功能［8］。因此，辛伐他汀究竟通過(guò)何種機(jī)制影響肝癌細(xì)胞的GJ功能還有待進(jìn)一步研究加以闡明。

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The effect of simvastatin on the gap junction function of hepatocellular carcinoma cells

WANG Ling-zhi1, PENG Jian-xin2, YU Mei-ling3, HUANG Huan-sen1
(1.Department of Anesthesia, the Second Af fi liated Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou Guangdong 510260, China; 2.Department of Hepatobiliary Surgery, Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital, Guangzhou Guangdong 510120, China; 3.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu Anhui 233004, China)

HUANG Huan-sen E-mail: huanghs1966@163.com

Background and purpose: It has been reported that gap junctional (GJ) function was signi fi cantly decreased in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and cell lines. However, the increased GJ suppress tumorigenesis and the development of liver cancer. This study therefore aimed to examine the effect of simvastatin on GJ function between Hep3b cells. Thus, the exploition of drugs to increase GJ function between liver cancer cells will provide an ef fi cient approach to fi ght against liver tumor as well as increase cytotoxicity of antitumor agents. Methods: SRB was used to assay the toxicity of simvastatin. The effect of simvastatin on GJ function was determined by “Parachute”dye-coupling assay and scrape loading/dye transfer assay. Results: Pretreated Hep3b cells with simvastatin at the concentration of 1, 5 or 10 μmol/L for 24 h did not induce the cytotoxicity. So simvastatin at the concentration of 5 and 10 μmol/L would not reduce the amount of GJ on cell membranes. “Parachute” dye-coupling assay showed that the treatment with 5 and 10 μmol/L simvastatin for 4 h enhanced the dye spread through GJ in Hep3b cells. Similarly, scrape loading/dye transfer assay showed that simvastatin could induce the increasing spread of lucifer yellow (Ly, Sigma) around the sco fi ng cells with increasing concentrations. Conclusion: Simvastatin could increase the GJ function of Hep3b cells.

Simvastatin; Gap junction; Hepatoma carcinoma

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.09.001

R735.7

A

1007-3639(2014)09-0641-05

2014-03-22

2014-04-22）

廣州市博士啟動(dòng)項(xiàng)目(No：2011c49)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(No：20141A011083)。

黃煥森 E-mail:huanghs1966@163.com