王芬王潔白樺王書航王樹濱申東蘭

1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院腫瘤科，廣東 深圳 518036；

2.北京腫瘤醫(yī)院胸部腫瘤內(nèi)科，北京 100036

晚期非小細(xì)胞肺癌EGFR蛋白磷酸化、基因突變與EGFR-TKI療效相關(guān)性的研究

王芬1王潔2白樺2王書航2王樹濱1申東蘭1

1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院腫瘤科，廣東 深圳 518036；

2.北京腫瘤醫(yī)院胸部腫瘤內(nèi)科，北京 100036

背景與目的：近年來以吉非替尼和厄洛替尼為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI)，因其在晚期非小細(xì)胞肺癌(advanced non-small cell lung cancer，NSCLC)治療中獨特的臨床療效和較低的不良反應(yīng)而備受關(guān)注。盡管EGFR基因突變是目前認(rèn)為最確切的預(yù)測EGFR-TKI療效的指標(biāo)，但與臨床療效間并非“全或無”的關(guān)系，提示仍有其他機制參與其中。本研究旨在探討晚期NSCLC組織標(biāo)本中EGFR磷酸化酪氨酸1068(EGFR-pTyr1068)、1173(EGFR-pTyr1173)表達與EGFR基因突變的關(guān)系，及其在EGFR-TKI治療中的療效預(yù)測價值。方法：采用變性高效液相色譜法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)檢測205例晚期NSCLC患者組織中EGFR基因突變(19、21外顯子突變)情況；并采用免疫組化方法檢測其EGFR-pTyr1068、EGFR-pTyr1173表達。結(jié)果：晚期NSCLC患者組織中EGFR-pTyr1068和1173表達陽性率分別為80.0%(164/205)、57.6%(95/165)；其表達與臨床病理特征(年齡、性別、病理類型、吸煙狀態(tài)、疾病分期)無相關(guān)性。全組EGFR基因突變率為44.9%(92/205)，與吸煙狀態(tài)有關(guān)(P=0.024)，而與其他臨床病理特征(性別、年齡、病理類型、疾病分期)無關(guān)。EGFR基因突變與EGFR-pTyr1068表達呈弱相關(guān)性(P＜0.001)，與EGFR-pTyr1173無相關(guān)性(P=0.297)。EGFR基因突變型患者EGFR-TKI治療的客觀緩解率(objective response rate，ORR)、疾病控制率(disease control rate，DCR)和中位無進展生存期(progress free survival，PFS)分別為48.3%(43/89)、80.9%(72/89)和8.8個月(95%CI：6.11～11.42)，均明顯高于EGFR基因野生型患者［16.2%(17/105)、56.2%(59/105)和2.1個月，95%CI：0.89～3.24］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，P＜0.001，P=0.024)；EGFR-pTyr1068表達陽性患者ORR和DCR分別為37.7%(58/154)和74.7%(115/154)，均明顯高于表達陰性患者［5.0%(2/40)和40.0%(16/40)］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。EGFR-pTyr1068表達陽性患者中位PFS為7.0個月，較表達陰性患者(1.2個月)明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。而EGFR-pTyr1173表達與EGFR-TKI療效呈負(fù)相關(guān)性，EGFR-pTyr1173陽性者ORR、DCR和PFS分別為27.8%(25/90)、64.4%(58/90)和4.8個月，顯著低于陰性患者［37.9%(25/66)、83.3%(55/66)和7.7個月，P=0.123，P=0.007，P=0.016］。以EGFR基因突變狀態(tài)分層進行亞組分析顯示，在EGFR基因野生型患者中，EGFR-pTyr1068表達陽性率為69.0%(69/100)，EGFR-pTyr1068表達陽性和陰性患者ORR分別為23.2%(16/69)和3.2%(1/31)，DCR分別為69.6%(48/69)和35.5%(11/31)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.010，P=0.001)；EGFR-pTyr1068表達陽性患者中位PFS為3.6個月，較表達陰性患者(1.2個月)明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。16例EGFR-pTyr1068陽性表達且對EGFRTKI有效患者，中位PFS為15.6個月(95%CI：7.28～23.9)。多因素分析顯示，EGFR-pTyr1068是EGFR基因野生型患者EGFR-TKI治療的獨立療效預(yù)測因子(OR=0.24，95%CI：0.16～0.37，P＜0.001)。結(jié)論：EGFR-pTyr1068可作為晚期NSCLC患者接受EGFR-TKI治療的有效預(yù)測因子，尤其對從EGFR基因野生型患者中篩選EGFR-TKI治療有效者具有重要作用。

晚期非小細(xì)胞肺癌；表皮生長因子受體磷酸化酪氨酸；表皮生長因子受體基因突變；表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑；預(yù)測因子

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。以吉非替尼和厄洛替尼為代表的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)靶向治療在取得明顯療效的同時又避免傷害正常細(xì)胞［1-2］，越來越被腫瘤醫(yī)師和廣大患者所認(rèn)同。2004年Lynch等［3］和Paez等［4］分別報道了EGFR基因突變與EGFR-TKI療效的關(guān)系，之后的多組前瞻性臨床研究均證實EGFR基因突變是EGFR-TKI療效的有效預(yù)測因子［5-6］，并由此奠定了晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)一線治療選擇的新策略-基于EGFR基因突變狀態(tài)與組織學(xué)類型的策略選擇。

EGFR是一種相對分子質(zhì)量為170×103的穿膜糖蛋白，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路中起重要作用。EGFR一旦被激活，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活化和受體自身磷酸化，后者通過Ras-Raf-MAPK、JAK-STAT和PI3K-Akt等信號傳導(dǎo)途徑將信號傳遞到核內(nèi)，從而促使細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移和抑制細(xì)胞凋亡［7-12］。EGFR-TKI通過與ATP競爭性結(jié)合EGFR的胞內(nèi)部分直接抑制EGFR酪氨酸激酶并減少EGFR自身磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯和促進凋亡［13］。研究表明，EGFR基因突變可持續(xù)活化EGFR酪氨酸激酶，并使受體自身磷酸化［3,14-15］，提示EGFR酪氨酸磷酸化對活化后EGFR在細(xì)胞內(nèi)信號調(diào)控至關(guān)重要。目前國內(nèi)外對肺癌EGFR磷酸化發(fā)生率報道不一致，其與EGFR基因突變的關(guān)系各個報道亦相差甚遠(yuǎn)，且尚無大樣本的研究探討磷酸化EGFR與EGFR-TKI臨床療效的關(guān)系。本研究回顧性分析晚期NSCLC患者組織標(biāo)本中EGFR磷酸化酪氨酸1068(EGFR-pTyr1068)和1173(EGFR-pTyr1173)表達與EGFR基因突變、拷貝數(shù)的關(guān)系，并探討其對晚期NSCLC患者，尤其EGFR野生型患者接受EGFR-TKI治療的療效預(yù)測價值。

1 資料和方法

1.1 患者資料

收集2003年1月—2010年6月北京腫瘤醫(yī)院胸部腫瘤內(nèi)科收治的205例ⅢB和Ⅳ期NSCLC患者的臨床資料。所有患者均進行組織EGFR基因突變和EGFR-pTyr1068檢測，165例患者同時進行EGFR-pTyr1173檢測。194例患者接受EGFRTKI治療(148例接受吉非替尼250 mg/d治療；57例接受厄洛替尼150 mg/d治療)，直至疾病進展或出現(xiàn)難以耐受的不良反應(yīng)或患者拒絕用藥，其中54例為一線治療。中位隨訪時間為9.4個月(0.4～77.2個月)。

1.2 方法

1.2.1 D N A提取與變性高效液相色譜法(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)檢測EGFR突變

按照E.Z.N.A FFPE DNA試劑盒(購自美國OMEGA公司)說明書提取DNA后，PCR擴增EGFR第19、21外顯子，引物設(shè)計見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中模板cDNA 1.5 μL，10×PCR緩沖液1.5 μL，dNTP 0.375 μL，上、下游引物各0.15 μL，Taq酶0.15 μL，dH2O 11.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s；循環(huán)45次后，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠100 V電泳30 min后，溴化乙錠染色攝片進行擴增產(chǎn)物鑒定。用WAVE核苷酸片段分析系統(tǒng)(購自美國Transgenomic公司)進行DHPLC分析，色譜柱為DNA Sep分析柱，流動相為0.1 mol/L N-三乙基乙酰胺(TEAA，色譜純)和不同濃度的乙腈梯度洗脫液，由控制軟件WAVE Maker根據(jù)待測DNA序列自動生成乙腈梯度和柱溫，以0.9 mL/min流速測定，檢測器為紫外分光光度計(260 nm)。陽性結(jié)果判斷：外顯子19的突變類型為15～18 bp堿基刪除突變，利用DHPLC在50 ℃非變性條件下對片段長度進行測定，野生型產(chǎn)物為151 bp，刪除突變產(chǎn)物由于片段較短(136～133 bp)會先于野生型產(chǎn)物出現(xiàn)而與野生型峰明顯分離。外顯子21的突變類型為L858R置換突變，采用部分變性溫度進行測定，先將PCR產(chǎn)物變性復(fù)性處理，若存在突變會形成雜合雙鏈，其退火溫度低于純合雙鏈，61 ℃部分變性條件下可將2種產(chǎn)物分離。將測序驗證為外顯子19刪除突變陽性以及外顯子21置換突變陽性的冰凍標(biāo)本作為陽性對照，以注射用水作為空白對照進行DHPLC檢測。前期我們實驗室工作已經(jīng)提示DHPLC法與測序法相比，靈敏度、特異度高［22］，故本研究結(jié)果僅用DHPLC法檢測EGFP突變。

表1 EGFR基因引物序列Tab. 1 EGFR gene primer sequence

1.2.2 免疫組化學(xué)法檢測組織EGFR磷酸化酪氨酸表達

本研究采用Cell Signaling Technology (Danvers，MA)公司的EGFR磷酸化酪氨酸抗體：EGFR-pTyr1068(Cad no.2236)和EGFR-pTyr1173(Cad no.4407)。采用鏈菌素親生物素-過氧化物酶法(SP法)進行免疫組化染色。切片脫蠟至水，置于1 mmol/L EDTA(pH=8.0)抗原修復(fù)液中，用高壓鍋加熱至噴氣后改為400 W 10 min，緩慢冷卻至室溫。用PBS洗滌后，按試劑盒說明進行EGFR磷酸化酪氨酸的免疫組化染色。實驗以PBS代替一抗作為陰性對照，以該公司提供的EGFR磷酸化酪氨酸陽性切片(Cad no.8102)為陽性對照。切片經(jīng)顯色和蘇木精復(fù)染后，采用雙盲法對每張切片在高倍鏡(×400)下計數(shù)10個視野。染色結(jié)果根據(jù)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜著色的陽性細(xì)胞百分率和陽性染色程度評價。著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分率≤5%為0分；＞5%～＜20%為1分；≥20%～＜50%為2分；≥50%為3分。再結(jié)合染色強度，無色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。染色強度和著色細(xì)胞百分率的乘積即為其最后評分：總分＜2為陰性，≥2為陽性。

1.2.3 療效評價

依據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)進行療效評價，分為完全緩解(complete response，CR)；部分緩解(partial response，PR)；疾病進展(progressive disease，PD)和疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)。以CR+PR計算客觀緩解率(objective response rate，ORR)，以CR+PR+SD計算疾病控制率(disease control rate，DCR)。無疾病進展時間(progress free survival，PFS)定義為從第一次EGFR-TKI給藥至疾病進展或死亡。總生存期(overall survival，OS)定義為開始口服EGFR-TKI治療至患者死亡或末次隨訪時間。數(shù)據(jù)截止日尚生存的患者或在研究中失訪的患者，將以最后一次隨訪日期結(jié)尾數(shù)值進行分析。末次隨訪時間截止至2010年6月，有7例(3.4%)失訪，85例(42.9%)死亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 16.0進行統(tǒng)計學(xué)處理。EGFR基因突變和EGFR磷酸化檢測結(jié)果與臨床特征、EGFR-TKI療效采用χ2檢驗；多因素分析用logistic回歸方法分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理特征

入組205例患者中99例為男性，74例為吸煙或有吸煙史者，中位年齡61歲(28～84歲)。169例腺癌患者，168例為Ⅳ期患者。臨床病理特征見表2。

2.2 生物標(biāo)志物與EGFR-TKI療效關(guān)系分析

2.2.1 EGFR基因突變

EGFR基因突變陽性率為44.9%(92/205)，其中19外顯子突變陽性率為24.4%(50/205)，21外顯子突變陽性率為17.1%(35/205)，7例患者同時具有19和21外顯子突變(3.4%，圖1)。EGFR基因突變與吸煙狀態(tài)有關(guān)，非吸煙者具有更高的EGFR基因突變率(P=0.024)，而與其他臨床病理特征(性別、年齡、病理類型、疾病分期)無關(guān)(P＞0.05，表3)。

在194例接受EGFR-TKI治療的患者中，51例為一線治療，其余為二線或多線治療。63例患者PD，71例SD，60例PR，無CR患者。EGFR基因突變型患者ORR和DCR均明顯高于野生型［ORR：48.3%(43/89) vs 16.2%(17/105)；DCR：80.9%(72/89) vs 56.2%(59/105)］，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.001)。將EGFR基因突變與臨床病理特征進行多因素分析發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變是EGFR-TKI療效的獨立預(yù)測因子(OR=0.18，95%CI：0.09～0.38，P＜0.001)。以EGFR-TKI治療線數(shù)分層進行亞組分析顯示，無論EGFR-TKI作為一線還是二線及多線治療，EGFR基因突變型ORR均高于野生型［一線ORR：59.1%(13/22) vs 24.1%(7/29)；二線及多線ORR：46.9%(30/65) vs 14.1%(10/73)］，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012，P＜0.001，表4)。同樣，EGFR基因突變型患者PFS顯著長于野生型(中位PFS：8.8個月vs 2.1個月，P=0.024，圖2)。

2.2.2 EGFR磷酸化酪氨酸1068表達

E G F R-p T y r 1 0 6 8表達陽性率為80.0%(164/205)，其表達與臨床病理特征(年齡、性別、病理類型、吸煙狀態(tài)、疾病分期)均無明顯相關(guān)性(圖3，表3)。

表2 205例患者臨床病理特征Tab. 2 Clinicopathologic characteristics of 205 patients

圖1 EGFR 19、21外顯子突變DHPLC峰圖Fig. 1 EGFR 19 exon, 21 exon mutation by DHPLC

表4 EGFR基因突變與EGFR-TKI療效關(guān)系Tab. 4 Relationship between EGFR mutation and EGFR-TKI ef fi cacy

圖2 不同生物標(biāo)志物與PFS生存曲線圖Fig. 2 Progress free survival curves according to each biomarker

圖3 免疫組化學(xué)檢測EGFR磷酸化酪氨酸表達Fig. 3 EGFR phosphorylation at tyrosine 1068 (pTyr1068) and 1173 (pTyr1173) by IHC

對EGFR-pTyr1068表達與EGFR-TKI療效關(guān)系分析顯示，兩者呈顯著正相關(guān)。在接受EGFR-TKI治療的患者中，EGFR-pTyr1068表達陽性患者ORR和DCR分別為37.7%(58/154)和74.7%(115/154)，均明顯高于表達陰性患者［5.0%(2/40)和40.0%(16/40)］，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.001，表2)。EGFR-pTyr1068表達陽性患者中位PFS為7.0個月，較表達陰性患者(1.2個月)明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，圖2)。多因素分析顯示，EGFR-pTyr1068表達是EGFR-TKI的ORR(OR=0.24，95%CI：0.16～0.37，P＜0.001)和PFS(HR=0.21，95%CI：0.13～0.34，P＜0.001)的獨立影響因素。

以EGFR基因突變狀態(tài)分層進行亞組分析顯示(表5，圖4)，在EGFR基因野生型患者中，EGFR-pTyr1068表達陽性率為69%(69/100)。EGFR-pTyr1068表達陽性和表達陰性患者ORR分別為23.2%(16/69)和3.2%(1/31)，DCR分別為69.6%(48/69)和35.5%(11/31)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.010，P=0.001)；EGFR-pTyr1068表達陽性患者中位PFS為3.6個月，較表達陰性患者(1.2個月)明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。在EGFR基因野生型患者中，EGFRTKI治療17例達到PR，其中16例EGFR-pTyr1068表達陽性；SD患者53例，48例EGFR-pTyr1068表達陽性，進一步分析顯示，16例EGFR-pTyr1068表達陽性，且對EGFR-TKI治療有效患者的中位PFS為15.6個月(95%CI：7.28～23.9，圖5)。多因素分析顯示，EGFR-pTyr1068是EGFR基因野生型患者EGFR-TKI治療的獨立療效預(yù)測因子(HR=0.17，95%CI：0.08～0.34，P＜0.001)。

2.2.3 EGFR磷酸化酪氨酸1173表達

E G F R-p T y r 1 1 7 3表達陽性率為57.6%(95/165)，其表達與臨床病理特征(年齡、性別、病理類型、吸煙狀態(tài)、疾病分期)均無明顯相關(guān)性(圖3，表2)。

表5 以EGFR基因突變狀態(tài)分層分析EGFR-pTyr1068與EGFR-TKI療效關(guān)系Tab. 5 Relationship between EGFR-pTyr1068 and EGFR-TKI ef fi cacy strati fi ed by EGFR mutational status

圖4 以EGFR基因突變狀態(tài)分層不同亞組PFS生存曲線圖Fig. 4 Progression-free survival curves strati fi ed by EGFR mutational status

圖5 16例EGFR基因野生型且pTyr-1068表達陽性對EGFRTKI有效者PFS生存曲線圖Fig. 5 Progress free survival curves of 16 patients’ response to EGFR-TKI with EGFR wild status and pTyr1068 positive

對EGFR-pTyr1173表達與EGFR-TKI療效關(guān)系分析顯示，兩者呈負(fù)相關(guān)，即EGFR-pTyr1173表達陰性者具有更好的療效和更長的PFS。盡管在ORR方面EGFR-pTyr1173表達陽性患者與表達陰性者差異無統(tǒng)計學(xué)意義［27.8%(25/90) vs 37.9%(25/66)，P=0.123］，但與EGFR-pTyr1173表達陽性和表達陰性患者DCR分別為64.4%(58/90)和88.3%(58/66)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007)。EGFR-pTyr1173表達陽性患者中位PFS為4.8個月，較EGFR-pTyr1173表達陰性患者(7.7個月)明顯縮短(P=0.009，圖2)。

2.3 生物標(biāo)志物間相互關(guān)系分析

EGFR-pTyr1068表達與EGFR基因突變呈弱相關(guān)，在EGFR基因突變型和野生型患者中，EGFR-pTyr1068表達陽性率分別為92.3%(84/91)和70.8%(80/113)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)；EGFR-pTyr1173表達與EGFR基因突變和EGFR-pTyr1068表達均無明顯相關(guān)性(表6)。將3組生物標(biāo)志物進行組合分析顯示，同時具有EGFR突變陽性、EGFR-pTyr1068表達陽性和EGFR-pTyr1173表達陰性者對EGFR-TKI具有最好的療效和生存獲益［ORR為66.7%(20/30)，DCR為96.7%(29/30)，中位PFS為12.8個月，P＜0.001，表7］。但這一結(jié)果因例數(shù)少缺乏說服力。

表6 EGFR基因突變與磷酸化EGFR表達間關(guān)系Tab. 6 Relationship between EGFR mutation and EGFR phosphorylations

表7 生物標(biāo)志物組合分析Tab. 7 Combinatory analysis of biomarkers

3 討 論

蛋白質(zhì)磷酸化是信號傳導(dǎo)過程中的重要事件，在細(xì)胞生長、增殖、分化特別是細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，是細(xì)胞癌變的重要表現(xiàn)之一，可能是細(xì)胞增殖、分化的關(guān)鍵。目前研究已經(jīng)確認(rèn)EGFR的5個自身磷酸化位點，均位于EGFR細(xì)胞內(nèi)區(qū)羧基端亞區(qū)的194個氨基酸殘基上。其中，酪氨酸(Tyr)1068、1148和1173被稱為主要位點；而Tyr992和1086被稱為次要位點［16］。其他磷酸化位點還包括Tyr845、1045等。研究證明許多癌基因的編碼產(chǎn)物是酪氨酸蛋白，它被酪氨酸激酶磷酸化后被激活形成磷酸化酪氨酸蛋白。酪氨酸磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯修飾的一種形式，雖然磷酸化的酪氨酸在整個蛋白中濃度較低，但在信號傳導(dǎo)過程中起了關(guān)鍵作用［17］。酪氨酸磷酸化所介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑具有多向性，包括細(xì)胞增殖、遷移、分化和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，下游信號的級聯(lián)反應(yīng)取決于不同位點磷酸化。干擾EGFR磷酸化能抑制下游事件的發(fā)生，如導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和延緩腫瘤生長［8］。體外細(xì)胞系研究顯示，當(dāng)EGFR基因突變時，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)配體誘導(dǎo)的EGFR磷酸化表達水平具有顯著差異，而總EGFR表達無明顯差異［18-19］。在EGFR-TKI敏感型細(xì)胞系中磷酸化EGFR蛋白表達明顯增加，總EGFR蛋白卻無此變化?；诹姿峄疎GFR是EGFR的活性形式，本研究回顧性分析晚期NSCLC患者組織標(biāo)本中活化EGFR即磷酸化EGFR表達與EGFR基因突變的關(guān)系，并探討其表達對晚期NSCLC患者，尤其EGFR基因野生型患者接受EGFR-TKI治療的療效預(yù)測價值。結(jié)果顯示EGFR基因突變與EGFR-pTyr1068磷酸化表達呈弱相關(guān)性，而與EGFR-pTyr1173表達無關(guān)，與國外研究報道一致［20-22］，提示EGFR基因突變最初可能通過改變EGFR-pTyr1068磷酸化水平繼而影響細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。

本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織標(biāo)本中E G F R-pTyr1068表達能有效預(yù)測EGFR-TKI療效，在所有接受EGFR-TKI治療的患者中，EGFR-pTyr1068表達陽性者ORR和PFS均優(yōu)于表達陰性者。并且EGFR-pTyr1068對EGFR-TKI的預(yù)測作用并非隸屬于或伴隨于EGFR基因突變，而是獨立存在。以EGFR基因突變狀態(tài)分層進行亞組分析顯示，在EGFR基因野生型患者中，EGFRTKI治療17例達到PR，其中16例EGFR-pTyr1068表達陽性；在53例獲得SD的患者中，48例EGFR-pTyr1068表達陽性。這組EGFR-pTyr1068表達陽性的患者PFS較陰性者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(中位PFS：3.6個月 vs 1.2個月，P＜0.001)。即EGFR-pTyr1068表達可以從EGFR基因野生型的患者中再篩選出94.1%(16/17)對EGFR-TKI敏感、81.4%(48/59)可從EGFR-TKI治療中獲得疾病穩(wěn)定的患者。提示EGFR-pTyr1068表達可能成為EGFR基因突變的補充篩選遺漏。

正如體外細(xì)胞系研究證實，EGFR胞內(nèi)段磷酸化位點常作為一系列蛋白分子的停泊位點并激活下游級聯(lián)信號反應(yīng)［11,20］，pTyr1068位點與激活A(yù)kt信號有關(guān)［11,23-24］，因而成為EGFR活化的標(biāo)志。Helfrich等［25］研究顯示不單在EGFR突變型細(xì)胞系株(H3255)，而且在吉非替尼敏感的野生型細(xì)胞株(H322和Calu3)中均發(fā)現(xiàn)pTyr1068高表達，同時高表達者對吉非替尼亦更敏感。Amann等［26］研究發(fā)現(xiàn)在吉非替尼敏感細(xì)胞株中存在EGFR持續(xù)磷酸化，突變型細(xì)胞株的磷酸化水平明顯高于野生型細(xì)胞株。這些實驗結(jié)果說明EGFR磷酸化可以不依賴于EGFR基因突變而被激發(fā)并激活下游信號傳導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因野生型患者亦可EGFR磷酸化高表達，也許可解釋為何10%～20%無EGFR基因突變的患者仍對吉非替尼或厄洛替尼有效。

Hijiya等［27］對另一個磷酸化位點Tyr1173進行研究顯示，其表達與吉非替尼療效無關(guān)。Emery等［28］研究卻發(fā)現(xiàn)EGFR-TKI治療中pTyr1173高表達者具有更長的TTP。本研究與此相反，pTyr1173表達與靶向治療療效呈負(fù)相關(guān)，pTyr1173表達陽性者PFS更短，預(yù)后更差。pTyr1173主要為Shc提供停泊位點而與MAPK信號通路活化有關(guān)，提示MAPK信號通路異常調(diào)節(jié)可能使晚期NSCLC患者對EGFR-TKI治療抵抗。已有臨床研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號活化可能對腫瘤細(xì)胞具有抗凋亡和導(dǎo)致吉非替尼耐藥的作用［29］，但需要更多研究加以證實。

本研究結(jié)果證實，EGFR基因突變是EGFRTKI療效和生存的強烈預(yù)測因子；EGFR-pTyr1068表達對從EGFR野生型患者中篩選EGFR-TKI治療有效者具有潛在的意義。此外，本組EGFR野生型患者的ORR高于文獻報道［19,30-31］?？赡茉驗椋孩俦狙芯繛閲鴥?nèi)單中心研究，入組者均為中國大陸患者；②本研究入組的大部分患者均以一線治療前或手術(shù)時所獲取的組織學(xué)標(biāo)本檢測EGFR基因突變狀態(tài)，而非利用EGFR-TKI治療前的即時標(biāo)本進行檢測。前期的化療可能改變EGFR基因突變狀態(tài)，使之難以正確反映EGFR-TKI二、三線治療前EGFR基因突變的真實狀態(tài)；③腫瘤組織內(nèi)及原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶之間的異質(zhì)性影響EGFR基因檢測及其臨床預(yù)測作用。

綜上所述，EGFR-pTyr1068可能作為晚期NSCLC患者接受FR-TKI治療的有效預(yù)測因子，尤其對從EGFR野生型患者中篩選EGFR-TKI治療有效者具有重要作用，但尚需前瞻性、多中心的研究驗證，使晚期NSCLC患者個體化EGFR-TKI治療的預(yù)測更為精準(zhǔn)。

［1］ SHEPHERD F A, RODRIGUES P J, CIULEANU T, et al. Erlotinib in previously treated non-small-cell lung cancer［J］. N Engl J Med, 2005, 353(2): 123-132.

［2］ KIM E S, HIRSH V, MOK T, et al. Gefitinib versus docetaxel in previously treated non-small-cell lung cancer (INTEREST): a randomised phase Ⅲ trial ［J］. Lancet, 2008, 372(9652): 1809-1818.

［3］ LYNCH T J, BELL D W, SORDELLA R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib［J］. N Engl J Med, 2004, 350(21): 2129-2139.

［4］ PAEZ J G, JANNE P A, LEE J C, et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy ［J］. Science, 2004, 304(5676): 1497-1500.

［5］ HAN S W, KIM T Y, HWANG P G, et al. Predictive and prognostic impact of epidermal growth factor receptor mutation in non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib［J］. J Clin Oncol, 2005, 23(11): 2493-2501.

［6］ PAO W, MILLER V, ZAKOWSKI M, et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from ''never smokers'' and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib anderlotinib ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(36): 13306-13311.

［7］ HANAHAN D, WEINBERG R A. The hallmarks of cancer［J］. Cell, 2000, 100(1): 57-70.

［8］ HYNES N E, LANE H A. ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors ［J］. Nat Rev Cancer, 2005, 5(5): 341-354.

［9］ SCHULZE W X, DENG L, MANN M. Phosphotyrosine interactome of the ErbB-receptor kinase family ［J］. Mol Syst Biol, 2005, 1: 8.

［10］ GAZDAR A F, MINNA J D. Inhibition of EGFR signaling: all mutations are not created equal ［J］. PLoS Med, 2005, 2(11): e377.

［11］ SCHLESSINGER J. Common and distinct elements in cellular signaling via EGF and FGF receptors ［J］. Science, 2004, 306(5701): 1506-1507.

［12］ YARDEN Y. The EGFR family and its ligands in human cancer. signalling mechanisms and therapeutic opportunities［J］. Eur J Cancer, 2001, 37 Suppl 4: S3-8.

［13］ WAKELING A E, GUY S P, WOODBURN J R, et al. ZD1839 (Iressa): an orally active inhibitor of epidermal growth factor signaling with potential for cancer therapy ［J］. Cancer Res, 2002, 62(20): 5749-5754.

［14］ HAN S W, HWANG P G, CHUNG D H, et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) downstream molecules as response predictive markers for gefitinib (Iressa, ZD1839) in chemotherapy-resistant non-small cell lung cancer ［J］. Int J Cancer, 2005, 113(1): 109-115.

［15］ PARRA H S, CAVINA R, LATTERI F, et al. Analysis of epidermal growth factor receptor expression as a predictive factor for response to gefitinib (‘Iressa’, ZD1839) in nonsmall-cell lung cancer ［J］. Br J Cancer, 2004, 91(2): 208-212.

［16］ BISHAYEE S. Role of conformational alteration in the epidermal growth factor receptor (EGFR) function ［J］. Biochem Pharmacol, 2000, 60(8): 1217-1223.

［17］ ZWICK E, BANGE J, ULLRICH A. Receptor tyrosine kinases as targets for anticancer drugs ［J］. Trends Mol Med, 2002, 8(1): 17-23.

［18］ CAPPUZZO F, MAGRINI E, CERESOLI G L, et al. Akt phosphorylation and gefitinib efficacy in patients with advanced non-small-cell lung cancer ［J］. J Natl Cancer Inst, 2004, 96(15): 1133-1141.

［19］ CAPPUZZO F, LIGORIO C, JANNE P A, et al. Prospective study of gefitinib in epidermal growth factor receptor fluorescence in situ hybridization-positive/phospho-Aktpositive or never smoker patients with advanced non-smallcell lung cancer: the ONCOBELL trial ［J］. J Clin Oncol, 2007, 25(16): 2248-2255.

［20］ SORDELLA R, BELL D W, HABER D A, et al. Gefitinibsensitizing EGFR mutations in lung cancer activate antiapoptotic pathways ［J］. Science, 2004, 305(5687): 1163-1167.

［21］ OKABE T, OKAMOTO I, TAMURA K, et al. Differential constitutive activation of the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer cells bearing EGFR gene mutation and amplification ［J］. Cancer Res, 2007, 67(5): 2046-2053.

［22］ OKAMOTO I, KENYON LC, EMLET D R, et al. Expression of constitutively activated EGFRvIII in non-small cell lung cancer ［J］. Cancer Sci, 2003, 94(1): 50-56.

［23］ PURVIS J, ILANGO V, RADHAKRISHNAN R. Role of network branching in eliciting differential short-term signaling responses in the hypersensitive epidermal growth factor receptor mutants implicated in lung cancer ［J］. Biotechnol Prog, 2008, 24(3): 540-553.

［24］ MOSCATELLO D K, HOLGADO-MADRUGA M, GODWIN A K, et al. Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors ［J］. Cancer Res, 1995, 55(23): 5536-5539.

［25］ HELFRICH B A, RABEN D, VARELLA-GARCIA M, et al. Antitumor activity of the epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor gefitinib (ZD1839, Iressa) in non-small cell lung cancer cell lines correlates with gene copy number and EGFR mutations but not EGFR protein levels［J］. Clin Cancer Res, 2006, 12(23): 7117-7125.

［26］ AMANN J, KALYANKRISHNA S, MASSION P P, et al. Aberrant epidermal growth factor receptor signaling and enhanced sensitivity to EGFR inhibitors in lung cancer ［J］. Cancer Res, 2005, 65(1): 226-235.

［27］ HIJIYA N, MIYAWAKI M, KAWAHARA K, et al. Phosphorylation status of epidermal growth factor receptor is closely associated with responsiveness to gefitinib in pulmonary adenocarcinoma ［J］. Hum Pathol, 2008, 39(3): 316-323.

［28］ EMERY I F, BATTELLI C, AUCLAIR P L, et al. Response to gefitinib and erlotinib in non-small cell lung cancer: a restrospective study ［J］. BMC Cancer, 2009, 9: 333.

［29］ ZIMMER S, KAHL P, BUHL T M, et al. Epidermal growth factor receptor mutations in non-small cell lung cancer influence downstream Akt, MAPK and Stat3 signaling ［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 2009, 135(5): 723-730.

［30］ HAN S W, KIM T Y, JEON Y K, et al. Optimization of patient selection for gefitinib in non-small cell lung cancer by combined analysis of epidermal growth factor receptor mutation, K-ras mutation, and Akt phosphorylation ［J］. Clin Cancer Res, 2006, 12(8): 2538-2544.

［31］ YANG C H, YU C J, SHIH J Y, et al. Specific EGFR mutations predict treatment outcome of stage ⅢB/Ⅳ patients with chemotherapy-naive non-small-cell lung cancer receiving first-line gefitinib monotherapy ［J］. J Clin Oncol, 2008, 26(16): 2745-2753.

Relationship between EGFR protein phosphorylation, EGFR mutation and EGFR-TKI ef fi cacy in advanced non-small cell lung cancer

WANG Fen1, WANG Jie2, BAI Hua2, WANG Shu-hang2, WANG

Shu-bin1, SHEN Dong-lan1
(1.Department of Oncology, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen Guangdong 518036, China; 2.Department of Thoracic Oncology, Beijing Cancer Hospital, Beijing 100036, China)

WANG Fen E-mail: bonjourwf@gmail.com

Background and purpose: EGFR-TKI (EGFR-tyrosine kinase inhibitors), represented by ge fi tinib and erlotinib, have exhibited signi fi cant antiproliferative effects against non-small cell lung cancer (NSCLC) with low toxicity. EGFR gene mutation was discovered to be a predictive biomarker for EGFR-TKI treatment. Although the ef fi cacy of EGFR-TKI is limited to EGFR wild-type patients, it is still noticeable suggesting that some other mechanisms are responsible for it. The current study is aimed at evaluating the expression of phosphorylated EGFR in advanced NSCLC, investigating its relationship with EGFR mutations and EGFR-TKI ef fi cacy. Methods: EGFR gene mutations were detected by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) in 205 stageⅢB-ⅣNSCLC patients. The expressions of phosphorylated tyrosine 1068 (pTyr1068) and 1173 (pTyr1173) were detected by immunohistochemistry. Results: The positive expressions of pTyr1068 and pTyr1173 were 80.0% (164/205) and 57.6% (95/165) respectively. None of them were related to clinical pathological characteristics (age, gender, pathological type, smoking status, disease stage). EGFR gene mutation rate was 44.9% (92/205), which was only related to smoking status (P=0.024) compared to other clinical pathological characteristics. EGFR gene mutations were poorly related to pTyr1068 expression (P＜0.001) and not related to pTyr1173 expression (P=0.297). The objective response rate (ORR), disease control rate (DCR), and progressive free survival (PFS) of EGFR-TKI treatment in patients with EGFR mutations were 48.3% (43/89), 80.9% (72/89) and 8 months (95%CI: 6.11-11.42) respectively, which were signi fi cantly higher than that of EGFR wild-type patients [ORR=16.2% (17/105, P＜0.001); DCR=56.2% (59/105, P＜0.001); Median PFS: 2.1 months, (95%CI: 0.89-3.24; P=0.001)]. Superior ORR: DCR and PFS appeared in patients with pTyr1068 positive expression compared to negative [ORR: 37.7% (58/154) vs 5.0% (2/40, P＜0.001); DCR: 74.7% (115/154) vs 40.0% (16/40, P＜0.001); Median PFS: 7.0 months vs 1.2 months, P＜0.001)]. Inversely, the patients with pTyr1173 positive expression had lower ORR, DCR and shorter PFS [ORR: 27.8% (25/90) vs 37.9% (25/66, P=0.123); DCR: 64.4% (58/90) vs 83.3% (55/66, P=0.007); Median PFS: 4.8 months vs 7.7 months (P=0.016)]. In subgroup of EGFR wild-type patients, positive expression of pTyr1068 was 69.0% (69/100). EGFR wild-type patients with pTyr1068 positive expression had a prolonged PFS and elevated ORR and DCR compared to negative [median PFS: 3.6 months vs 1.2 months (P＜0.001); ORR: 23.2% vs 3.2% (P=0.010); DCR: 69.6% vs 35.5% (P=0.001)]. Sixteen patients with pTyr1068 positive expression who responded to EGFR-TKI treatment in this subgroup had a remarkable PFS [median PFS: 15.6 months (95%CI: 7.28-23.9)]. Multiple factor analysis showed that the expression of pTyr1068 was an independence predictor factor for EGFR-TKI treatment (OR=0.24, 95%CI: 0.16～0.37, P＜0.001). Conclusion: Phosphorylation at Tyr1068 of EGFR might be a potential predictive factor for clinical response and survival of EGFR-TKI treatment in patients with advanced NSCLC, especially in EGFR wild-type patients.

Advanced non-small-cell lung cancer; Epidermal growth factor receptor phosphorylation; Epidermal growth factor receptor mutation; Epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors; Predictive factor.

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.09.004

R734.2

A

1007-3639(2014)09-0657-12

2014-02-27

2014-04-30）

王芬 E-mail:bonjourwf@gmail.com