蘇海濤 王軍 鄒悅
青島地區(qū)結(jié)核分枝桿菌rpoB變異與耐藥相關(guān)性研究
蘇海濤 王軍 鄒悅
目的 探討青島地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的rpoB變異特征與利福平耐藥的關(guān)系。方法 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)直接測序法對來自青島地區(qū)54株利福平耐藥的結(jié)核分枝桿菌和14株利福平敏感的結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因片段進(jìn)行分析。結(jié)果 14株利福平敏感菌株中均未發(fā)生rpoB變異,而54株利福平耐藥菌株中有46株發(fā)生了rpoB變異,變異率為85.19%(46/54);rpoB變異在利福平敏感菌株和利福平耐藥菌株中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.072,P=0);16株利福平低濃度耐藥菌株中有10株發(fā)生rpoB變異,而38株利福平高濃度耐藥菌株中有36株發(fā)生rpoB變異,rpoB變異在利福平低濃度耐藥菌株和利福平高濃度耐藥菌株中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.893,P=0.009);30株單耐利福平菌株中有24株發(fā)生rpoB變異,而24株多耐藥菌株中有22株發(fā)生rpoB變異,rpoB變異在單耐利福平菌株和多耐藥菌株中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.022,P=0.025)。結(jié)論 rpoB的變異是青島地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥的主要機(jī)制,且可能與耐藥濃度及是否多耐藥相關(guān)。
結(jié)核分枝桿菌;rpoB;利福平;耐藥
利福平是抗結(jié)核化療方案中一個關(guān)鍵藥物,它在結(jié)核病化療中起著重要作用。但是,在我國結(jié)核菌對利福平的耐藥發(fā)生率呈上升局勢[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,結(jié)核菌耐藥的機(jī)制在基因水平已經(jīng)逐漸闡明。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌耐利福平與利福平作用的靶分子RNA聚合酶β亞單位的編碼基因rpoB突變有關(guān)[2]。本研究應(yīng)用PCR直接測序法檢測結(jié)核分枝桿菌耐多藥臨床分離株的rpoB基因,對青島地區(qū)利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌中rpoB的變異與利福平耐藥之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究,為明確青島地區(qū)利福平耐藥的分子特征、幫助臨床篩查耐利福平菌株及制定區(qū)域性耐藥肺結(jié)核的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案提供依據(jù)。
1.1 菌株來源和藥敏試驗(yàn) 68株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株均來源于青島市胸科醫(yī)院確診的繼發(fā)性肺結(jié)核患者,其中利福平敏感菌株14株,利福平耐藥菌株54株,根據(jù)《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程》進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)、抗酸染色、菌種鑒定,采用比例法按國際標(biāo)準(zhǔn)對分離的菌株進(jìn)行利福平的藥敏試驗(yàn)。利福平耐藥菌株中,低濃度耐藥菌株16例(藥物濃度為50μg/ml),高濃度耐藥菌株38例(藥物濃度為250μg/ml),利福平單耐藥菌株30例,多耐藥菌株(包含耐多藥)24例。
1.2 DNA制備與聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 取100μl菌懸液加自制的裂解液[(50mmol/L NaOH、10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1% Triton X-100、1%NP-40、0.5mmol/L EDTA(pH8.0)]200 μl,混勻,100℃煮沸 10 min,,12000r/min離心5min,離心半徑7.9cm,取上清液作模板。置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 PCR反應(yīng)
1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器 PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀(加拿大 BBI公司);3730測序列分析儀(美國 ABI公司);SW-CJ-1D潔凈工作臺(江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠);DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司);YXJ-2離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司);H6-1微型電泳槽(上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠);凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius公司);移液器(范圍 100~1000ml,20~200ml,0.5~10ml)(加拿大 BBI公司)。
1.3.2 主要試劑 TaqDNA聚合酶、10×PCR緩沖液(without Mg2+:100 mM Tris-HCl pH 8.8 at 25℃;500 mmol/L KCl,0.8%(v/v)Nonidet );MgCl2(25 mmol/L)、dNTP(10mmol/L)、Marker、6×DNA Loading Dye(生工生物工程上海有限公司);PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(生工生物工程上海有限公司SK1141);10×TAE(400mmol/L三羥基氨甲烷醋酸鹽Tris-acetate和10mmol/L乙二胺四乙酸二鈉EDTA,pH8.0)。
1.3.3 引物設(shè)計(jì) 在GeneBank中查到rpoB基因(888164)的全序列,根據(jù)rpoB基因序列設(shè)計(jì)PCR引物序列1對,由上海生工生物技術(shù)公司有限公司合成,序列如下(5'to3'):上游引物F AGGACGTGGAGGCGATCA,下游引物R AACGGGTTGACCCGCGCGTA,應(yīng)用上述引物對rpoB基因進(jìn)行擴(kuò)增的片段長度為358bp,包含81bp核心區(qū)。
1.3.4 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 采用50μl 體系,包括模板 1 μl、上下游引物各 1 μl、10mmol/LdNTP 1 μl、Taq緩沖液 5 μl、25mmol/L MgCl2 5 μl、5U/μl TaqDNA聚合酶 0.5 μl、水 36.3 μl;反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 3min,94℃變性 30s,55~60℃退火 35s,72℃延伸 40~50s,72℃修復(fù)延伸5~8min,35個循環(huán)。
1.4 測序 PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(生工生物工程上海有限公司SK1141),測序。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 68株臨床分離株rpoB基因擴(kuò)增后均得到長度為358 bp 的片段,擴(kuò)增陽性率為100%(見圖1)。
圖1 PCR擴(kuò)增rpoB基因片段
2.2 DNA測序結(jié)果 14株利福平敏感菌株中均未發(fā)生rpoB變異,而54株利福平耐藥株中有46株發(fā)生rpoB變異,基因變異率為 85.19%(46/54);46 株中 22 株(47.83%)為 81bp核心區(qū)531位密碼子TCG-TTG變異,18株(39.13%)為81bp核心區(qū)526位密碼子CAC-TAC變異,4株(8.70%)為81bp核心區(qū)
516位密碼子GAC-GTC變異,2株(4.35%)為516位和526位密碼子雙點(diǎn)變異。16株利福平低濃度耐藥菌株中有10株發(fā)生了rpoB變異,變異率為62.50%(10/16),其中6株為81bp核心區(qū)
531位密碼子TCG-TTG變異,4株為81bp核心區(qū)526位密碼子CAC-TAC變異;38株利福平高濃度耐藥菌株中有36株發(fā)生了rpoB變異,變異率為94.74%(36/38),其中16株為81bp核心區(qū)531位密碼子TCG-TTG變異,14株為81bp核心區(qū)526位密碼子CAC-TAC變異,4例為81bp核心區(qū)516位密碼子GAC-GTC變異,2例為516位和526位密碼子雙點(diǎn)變異。30株單耐利福平菌株中有24株發(fā)生rpoB變異,變異率為80.00%(24/30),而24株多耐藥菌株中有22株發(fā)生rpoB變異,變異率為 91.67%(22/24)。
2.2.1 rpoB變異特征及其與利福平耐藥表型的關(guān)系 14株利福平敏感菌株中均未發(fā)生rpoB變異,而54株利福平耐藥株中有46株發(fā)生rpoB變異,rpoB變異在利福平敏感菌株和利福平耐藥菌株中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見表1)。
2.2.2 利福平耐藥程度與rpoB變異關(guān)系 16株利福平低濃度耐藥菌株中有10株發(fā)生rpoB變異,而38株利福平高濃度耐藥菌株中有36株發(fā)生rpoB變異,rpoB變異在利福平低耐藥菌株和利福平高耐藥菌株中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見表 2)。
表1 利福平耐藥表型與rpoB變異關(guān)系(株)
表2 利福平耐藥程度與rpoB變異關(guān)系(株)
2.2.3 利福平耐藥菌株是否多耐藥與rpoB變異關(guān)系 30株單耐利福平菌株中有24株發(fā)生rpoB變異,而24株多耐藥菌株中有22株發(fā)生rpoB變異,rpoB變異在單耐利福平菌株和多耐藥菌株中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3)。
表3 利福平耐藥菌株是否多耐藥與rpoB變異關(guān)系(株)
rpoB基因全長3543個堿基,rpoB基因編碼合成核糖核酸的RNA的β亞單位。當(dāng)81bp核心區(qū)發(fā)生突變,利福平不能與RNA聚合酶β亞基結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)菌對利福平耐受,rpoB基因突變以531位、526位點(diǎn)突變最為常見[3],且以上兩個位點(diǎn)的突變是引起高水平耐藥的主要原因。除上述兩位點(diǎn)外,511、516、518、522位點(diǎn)也有突變,相對531和526較少,且是引起低水平耐藥的原因。除突變引起耐藥外,細(xì)胞壁滲透性的改變導(dǎo)致藥物攝入量的減少也是導(dǎo)致耐藥的原因之一[4]。本研究對來自青島地區(qū)的54株對利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的分析表明,85.19%(46/54)的對利福平耐藥菌株存在rpoB的變異,而14株對利福平敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中不存在rpoB的變異,本研究結(jié)果顯示rpoB的變異形式為點(diǎn)突變,尤其是81bp核心區(qū)531位、526位變異是青島地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥的主要機(jī)制。朱敏等[5]報(bào)道在耐利福平菌株中,rpoB基因突變率達(dá)88.9%,以526、531位點(diǎn)改變最常見。孫勇[6]報(bào)道在利福平耐藥菌株中,86.2%rpoB基因發(fā)生突變,突變主要集中在531、526、516 3個位點(diǎn)。周志紅等[7]報(bào)道岳陽地區(qū)53株利福平耐藥株中39株rpoB基因存在不同位點(diǎn)的變異,突變率為73.58%,突變位點(diǎn)包括531、526、522、516、513、511,最主要的突變位點(diǎn)集中在 531 和 526 位點(diǎn)。而國外報(bào)道[8],對利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因突變的發(fā)生率為92.7%~97.6%。產(chǎn)生上述差異的原因除了時間、地域及入選樣本量不同外,還與不同抽樣方法導(dǎo)致的結(jié)果差異性有關(guān)。
對利福平高濃度耐藥菌株rpoB的變異率明顯高于對利福平低濃度耐藥菌株,提示rpoB的變異與高濃度耐藥的相關(guān)性更高。多耐藥菌株rpoB的變異率顯著高于單耐利福平菌株,提示rpoB變異的結(jié)核分枝桿菌分離株可能更容易獲得對其他抗結(jié)核藥的額外耐藥。還有對利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌未發(fā)現(xiàn)rpoB的變異,其耐藥機(jī)制也可能是細(xì)胞膜通透性的改變,但也不能排除還存在利福平耐藥的其他機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。本研究樣本量較小,難以全面反映整個青島市的利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌rpoB的變異特征,這些需要以后加大樣本量,進(jìn)行深入的研究,以期獲得更加全面、精確的科學(xué)依據(jù)。
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Objective To investigate the relationship between rifampicin-resistance and mutation in rpoB of the tuberculosis mycobacterium from Qingdao area. Method The rpoB gene of 68 mycobacterium tuberculosis strains(54 rifampicin-resistant strains, 14 rifampicin-susceptible strains) were analyzed by the polymerase chain reaction direct sequencing technique. Results 46 of 54 rifampicin-resistant strains had mutation in rpoB,The mutation proportion is 85.19%; there was no gene change in rpoB of 14 rifampicin-susceptible strains. The mutation proportion in rpoB of rifampicin-resistant strains was signifi cantly higher than that of rifampicin-susceptible strains(χ2=33.072,P=0); 10 of 16 low-level rifampicinresistant strains had mutation in rpoB, 36 of 38 high-level rifampicin-resistant strains had mutation in rpoB, The high-level rifampicin-resistant strains had a higher frequency of rpoB mutations than low-level rifampicin-resistant strains(χ2=6.893,P=0.009); 24 of 30 single rifampicinresistant strains had mutation in rpoB, 22 of 24 multi-drug resistance tuberculosis strains had mutation in rpoB; The multi-drug resistance tuberculosis strains had a higher frequency of rpoB mutations than single rifampicin-resistant strains(χ2=5.022,P=0.025). Conclusion The investigation indicated that rpoB mutation is the major molecular to generate the rifampicin-resistance in Qingdao area, may be associated with the concentration of bacterial drug resistance and multidrug resistance.
Tuberculosis mycobacterium; rpoB; Rifampicin; Drug resistance
10.3969/j.issn.1009-4393.2014.10.004
山東省青島市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目 (09-1-1-27-nsh)
山東 266043 青島市胸科醫(yī)院 (蘇海濤 王軍 鄒悅)
蘇海濤 E-mail:sht152@163.com