董博文，管少花，董卉卉，趙志浩，李繼東

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山茱萸葉片DNA提取方法及ISSR反應(yīng)體系構(gòu)建

董博文1，管少花1，董卉卉2，趙志浩1，李繼東1

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002；2.信陽(yáng)市林業(yè)科學(xué)研究所，河南 464031）

山茱萸成熟葉片中多糖及多酚類物質(zhì)含量較高，傳統(tǒng)CTAB法提取其葉片DNA效果較差，該研究在傳統(tǒng)的CTAB提取法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，經(jīng)DNA原液電泳檢測(cè)及PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)表明，該法適用于提取硅膠快速干燥保存的山茱萸葉片的DNA。在此基礎(chǔ)上，對(duì)山茱萸ISSR反應(yīng)體系中的退火溫度、引物濃度及模板用量進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明，在25μL的反應(yīng)體系中，引物UBC847的最佳退火溫度為55.2℃，引物最佳濃度為0.8μmol/L，模板最佳用量為70 ng，初步構(gòu)建了山茱萸ISSR反應(yīng)體系。

山茱萸；DNA提取；ISSR

山茱萸，山茱萸科（）山茱萸屬，又名棗皮、山萸肉等，以果實(shí)入藥，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材[1]。其藥用功效在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《吳普本草》等典籍中均有記載[2]。近幾年，山茱萸由于其藥用價(jià)值，帶來(lái)了較高的經(jīng)濟(jì)效益，其種質(zhì)資源較為豐富但良莠不齊，利用DNA分子標(biāo)記，為分子水平上進(jìn)行山茱萸的品種選育奠定基礎(chǔ)，而進(jìn)一步提高山茱萸的經(jīng)濟(jì)效益成為了亟待解決的問(wèn)題。

山茱萸成熟葉片中有較高含量的多糖、多酚類等雜質(zhì)，對(duì)其DNA提取造成了一定困難，本實(shí)驗(yàn)在對(duì)傳統(tǒng)的CTAB法提取過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題以及提取后的產(chǎn)物進(jìn)行分析后，對(duì)該方法做出了改良，最終建立了適用于山茱萸成熟葉片的DNA提取方法。

ISSR是近年來(lái)在微衛(wèi)星技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，其以多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)、成本低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定[3]、遺傳作圖[4]、遺傳多樣性[5]等方面的研究。研究以山茱萸成熟葉片基因組DNA為模板，哥倫比亞大學(xué)公布的引物序列UBC847對(duì)山茱萸ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行構(gòu)建，以期對(duì)其做分子評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用山茱萸材料采自河南伏牛山山茱萸主產(chǎn)區(qū)西峽縣太平鎮(zhèn)，所采葉片迅速放入保鮮袋，加變色硅膠后封口保存。

1.2 試劑

實(shí)驗(yàn)所用的引物、PCR Master Mix、DNA marker(DL2000)均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司

1.3 DNA提取方法

參考李繼東[6]的方法并改進(jìn)。

研磨樣品（0.1 mg），研磨時(shí)加入少量PVP，裝入2 mL離心管。加入700μL預(yù)處理液（2%β-巰基乙醇，2%PVP，100 mmol/L EDTA，pH 8.0），離心10 min（10 000 r/m），棄去上清。加入700μL 65℃預(yù)熱2%CTAB裂解液，充分混合后65℃水浴60 min，10 min混勻1次。水浴結(jié)束后加入700μL酚︰氯仿︰異戊醇（25︰24︰1），充分混合后離心10 min（12 000 r/m），取上清。加入2倍體積-20℃無(wú)水乙醇，-20℃放置30 min，離心，棄上清。風(fēng)干后加入700μL無(wú)菌水溶解，加入700μL氯仿︰異戊醇（24︰1），充分混合后取上清。再次加入2倍體積-20℃無(wú)水乙醇，-20℃放置30 min，離心，棄上清，用75%的乙醇漂洗3次，風(fēng)干后加入150~200 v無(wú)菌水溶解，保存在-20℃冰箱備用。

1.4 DNA電泳檢測(cè)

DNA濃度和純度用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，并稀釋至50 ng/L，檢測(cè)OD260nm/280nm；2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA分子量和降解程度。

1.5 ISSR-PCR反應(yīng)體系設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)采用的PCR Master Mix可直接使用，故實(shí)驗(yàn)中只對(duì)退火溫度、引物濃度以及模板用量進(jìn)行篩選，退火溫度設(shè)置了54.2℃、54.7℃、55.2℃、55.7℃、56.2℃、56.7℃共6個(gè)梯度，引物濃度設(shè)置了0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0 μmol/L，模板用量設(shè)置了50 ng、60 ng、70 ng、80 ng，PCR Master Mix10μL，用無(wú)菌水補(bǔ)至反應(yīng)體系為25μL。

1.6 ISSR-PCR擴(kuò)增程序

在PTC-200基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，55.2℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存[7]。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度與純度檢測(cè)

在表1中可以看出改進(jìn)的CTAB法無(wú)論在濃度與純度上比較，效果都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了傳統(tǒng)的CTAB法，這可能是因?yàn)榍捌谀雍皖A(yù)處理液中加的PVP較好的除去了多酚類雜質(zhì)。

表1 改良CTAB 與常規(guī)CTAB 法提取效果

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品

圖1 山茱萸葉片DNA瓊脂糖凝膠電泳

M為IIIDNA marker； 第1～4泳道為改良CTAB法；第5～8泳道為常規(guī)CTAB法

由圖1能夠看出改良的CTAB法提取的DNA在電泳中的條帶明亮、清晰，而常規(guī)CTAB法提取的DNA樣品條帶模糊不清，這可能是由于蛋白質(zhì)、多糖、多酚類污染嚴(yán)重所導(dǎo)致的。

2.3 退火溫度的優(yōu)化

圖2 ISSR-PCR反應(yīng)體系中不同退火溫度的擴(kuò)增結(jié)果

M. Marker (D2000)；1-6. 54.2℃、54.7℃、55.2℃、55.7℃、56.2℃、56.7℃，primer 847

退火溫度是影響PCR產(chǎn)物的重要因素，過(guò)高會(huì)導(dǎo)致多態(tài)性低，而過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致特異性差，主帶不明顯，由圖2中可以看出退火溫度為55.2℃和55.7℃時(shí)條帶清晰且有特異性條帶，低于55.2℃時(shí)條帶特異性差，且主帶有彌散現(xiàn)象，而高于55.7℃時(shí)條帶不清晰，且多態(tài)性差。

2.4 模板用量的優(yōu)化

圖3 ISSR-PCR反應(yīng)體系中不同模板DNA濃度的擴(kuò)增結(jié)果

M. Marker (D2000)；1-4. 80 ng、70 ng、60 ng、50 ng，primer 847

模板用量是制約產(chǎn)物得率和特異性的重要因素，由圖3可以看出，50~80 ng的模板用量都能擴(kuò)增出條帶，但用量為50 ng時(shí)，條帶不清晰，而用量為80 ng時(shí)，出現(xiàn)了非特異性產(chǎn)物，這可能是由于用量過(guò)低時(shí)分子碰撞的概率低，而用量過(guò)高時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的復(fù)制。模板為60 ng時(shí)比70 ng的條帶清晰，故模板用量60 ng為最佳。

2.5 引物濃度的優(yōu)化

圖4 ISSR-PCR反應(yīng)體系中不同引物濃度的擴(kuò)增結(jié)果

M. Marker (D2000)；0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L，primer 847

引物濃度影響ISSR-PCR的產(chǎn)量和特異性，濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致無(wú)法測(cè)出所有ISSR位點(diǎn)[8]，而濃度過(guò)高則會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的復(fù)制[9]，且會(huì)增加引物之間形成二聚體的幾率。由圖4可以看出引物濃度在0.8時(shí)條帶最清晰且有多態(tài)性，故確定引物最佳濃度為0.8μmol/L。

3 結(jié)論與討論

DNA的提取是研究分子生物學(xué)的基本手段，目前提取DNA的方法有CTAB法、SDS法、SLS法等，而山茱萸基因組DNA的提取方法多為CTAB法，由于山茱萸成熟葉片中有較高含量的多糖和多酚類以及次生代謝物，所以常規(guī)的CTAB法在提取山茱萸成熟葉片DNA時(shí)，會(huì)導(dǎo)致多糖及多酚類去除不徹底，而且多酚類物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致褐化、抑制多種酶的活性。實(shí)驗(yàn)中的改良CTAB法采取了在磨樣時(shí)加入PVP、預(yù)處理液中加入PVP、β-巰基乙醇的措施，這樣可以有效的防止多酚類的褐化，并且能夠較好的除去多糖、多酚類物質(zhì)，而EDTA可以螯合二價(jià)金屬離子，抑制DNase的活性，防止DNA降解，從而獲得較高質(zhì)量的DNA。

由于山茱萸經(jīng)濟(jì)效益高，盡快選育其優(yōu)良品種成為了一種亟待解決的問(wèn)題，而ISSR分子標(biāo)記技術(shù)由于其多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)單等種種優(yōu)點(diǎn)，可以用于更好的對(duì)山茱萸進(jìn)行選育，而ISSR體系中的因素如退火溫度、模板用量、引物濃度都對(duì)PCR有著很大影響[10]。實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)置梯度對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行了篩選，最終建立了山茱萸ISSR-PCR反應(yīng)體系，即60 ng DNA模板、0.8μmol/L的引物、10μLPCR Master Mix，用無(wú)菌水補(bǔ)至25μL。該體系可以為以后的山茱萸良種選育奠定基礎(chǔ)。

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A Method for Extracting DNA from Mature Leaves ofand ISSR Reacting System Construction

DONG Bo-wen1,GUAN Shao-hua1,DONG Hui-hui2,ZHAO Zhi-hao1,LI Ji-dong1

(1. Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. Xinyang Forestry Science Research Institute, Henan 464031, China)

is a kind of medicinal plants with polysaccharide and polyphenol . Conventional CTAB method is useless for extracting DNA of.This study improved extraction method based on the Conventional CTAB method，and the result of the spectrophotometry，agarose gel electrophoresis and PCR indicated the improved CTAB method is suitable for the extracting DNA ofleaf stored in silica gel.Based on this, the annealing temperature,the concentration of primer and the dosage of DNA template is screened.All our results suggest that the 0.8μmol/L primer, 70ng DNA template and10μL Taq PCR Master Mix in a total volume of 20μL were suitable for ISSR—PCR amplification system of Comus officinalis. The optimal annealing temperature for primer UBC847 is 55.2℃ ．

Comus officinalis；DNA extraction；ISSR

S662.1

A

1003-2630（2014）01-0001-04

2014-03-15

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（201104047）

董博文（1989-），男，安徽阜陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事經(jīng)濟(jì)林種質(zhì)資源收集與評(píng)價(jià)方面的研究。

李繼東（1976-），男，河南南陽(yáng)人。博士，副教授，主要從事經(jīng)濟(jì)林栽培生理與良種選育方面的研究。E-mail :13903868540@139.com

（責(zé)任編輯：王文彬）