楊翠翠, 佟慧麗, 馬興紅, 杜巍, 劉丹, 楊宇, 嚴(yán)云勤

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030

利用TALEN技術(shù)在牛胎兒成纖維細(xì)胞中敲除Myostatin基因

楊翠翠, 佟慧麗, 馬興紅, 杜巍, 劉丹, 楊宇, 嚴(yán)云勤

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030

肌肉生長抑制素(Myostatin, MSTN)基因能夠負(fù)向調(diào)節(jié)骨骼肌的生長和發(fā)育, 牛 MSTN基因突變會出現(xiàn)“雙肌”特征。文章利用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)靶向敲除牛胎兒成纖維細(xì)胞的MSTN基因, 獲得敲除MSTN基因的細(xì)胞系, 為制備MSTN基因敲除牛提供材料。構(gòu)建一對MSTN基因的TALENs真核表達(dá)載體, 分別采用 PEI轉(zhuǎn)染試劑和電穿孔法進(jìn)行牛胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染, 測序結(jié)果表明 TALEN技術(shù)可用于敲除牛MSTN基因, 利用T7核酸內(nèi)切酶1(T7E1)檢測其突變效率, 結(jié)果顯示電穿孔轉(zhuǎn)染的敲除效率為20.4%。通過有限稀釋法, 共獲得10個MSTN基因敲除的細(xì)胞克隆(包括MSTN-/-和MSTN+/-), 其靶位點敲除的堿基數(shù)分別是1～20不等, 部分會出現(xiàn)移碼突變。出現(xiàn)移碼突變的細(xì)胞系可用于MSTN基因敲除的轉(zhuǎn)基因肉牛的制備。

TALENs; 牛; Myostatin; 敲除; 轉(zhuǎn)染

肌肉生長抑制素(Myostatin, MSTN)屬于 TGF-β超家族, 通過控制成肌細(xì)胞的大小、數(shù)量和增殖速度來實現(xiàn)對肌肉生長的負(fù)調(diào)控[1]。MSTN在肌肉組織中特異性表達(dá), 其活性的喪失或降低均會導(dǎo)致動物肌肉的過度發(fā)育, 表現(xiàn)為肌纖維直徑變大或肌纖維數(shù)增加, 動物出現(xiàn)“雙肌”性狀[2]。MSTN基因的自然突變能夠產(chǎn)生雙肌牛[3], 與正常牛相比其瘦肉率高且質(zhì)量好。因此, 通過基因敲除獲得具有育種能力的敲除MSTN基因的轉(zhuǎn)基因肉牛具有重要的生產(chǎn)實踐意義。

目前, 基因重組(Gene recombination)、鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)等基因敲除技術(shù)應(yīng)用于MSTN基因的研究報道很多[4～6], 但是存在一定的局限性, 如操作復(fù)雜、敲除效率低等, 很難獲得MSTN基因敲除的細(xì)胞系。2009年, 植物黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)中 TAL效應(yīng)子氨基酸序列與核酸靶序列的對應(yīng)關(guān)系被破譯, 利用TALEN技術(shù)進(jìn)行基因敲除的研究進(jìn)入了一個全新的發(fā)展階段。2010年, Christian等[7]利用AvrBs3和 PthXo1中天然存在的 TALE重復(fù)序列分別與FokⅠ融合, 通過人工構(gòu)建的TALENs實現(xiàn)了目標(biāo)DNA的切割。2011年, Miller等[8]采用TALEN技術(shù)定向突變?nèi)说膬?nèi)源性基因NTF3和CCR5, 首次在哺乳動物中實現(xiàn)了TALEN介導(dǎo)的基因打靶。隨著TALEN技術(shù)的迅速發(fā)展, 理論上TALEN能夠?qū)崿F(xiàn)對任意物種的基因打靶。

TALEN技術(shù)已在非洲爪蟾(Xenopus laevis)[9]、

1 材料和方法

1.1 材料

魯西黃牛(LXHN)由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。菌株 DH5α購于北京全式金生物技術(shù)有限公司, 4種TALE基本單元模塊載體pA(NI)、pC(HD)、pG(NN)和 pT(NG)以及 pCS2-0.5TALE-FokⅠ表達(dá)載體系列(簡稱 pCS2-FokⅠ表達(dá)載體)均由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張博教授贈送。

1.2 方法

1.2.1 單元組裝法構(gòu)建TALENs表達(dá)載體

根據(jù)靶點預(yù)測網(wǎng)站(https://tale-nt.cac.cornell. edu/)對 MSTN基因進(jìn)行靶點預(yù)測, 選用位于第二外顯子且含有常用酶切位點的基因作為靶點(表1)。通過反復(fù)的酶切-連接反應(yīng)構(gòu)建MSTN基因TALE重復(fù)序列的左、右靶點, 將TALE重復(fù)序列與CIAP(NEB)去磷酸化的 pCS2-FokⅠ表達(dá)載體相連, 構(gòu)建TALENs終載體pCS2-FokⅠ-MR和pCS2-FokⅠ-ML (TALENs表達(dá)載體)。質(zhì)粒圖譜見文獻(xiàn)[15]。

1.2.2 魯西黃牛(LXHN)原代胎兒成纖維細(xì)胞系的建立及轉(zhuǎn)染

酶消化法用含 20%胎牛血清(FBS,Gibco)的DMEM培養(yǎng)液(Gibco)分離培養(yǎng)和建立 LXHN原代胎兒成纖維細(xì)胞系。

按每2×106個細(xì)胞共轉(zhuǎn)染30 μg的TALENs表達(dá)載體, 將不含篩選標(biāo)記基因的 TALENs表達(dá)載體分別采用 PEI和電穿孔兩種轉(zhuǎn)染方式轉(zhuǎn)染生長至70%～80%的牛胎兒成纖維細(xì)胞中。

1.2.3 TALENs表達(dá)載體的活性檢測

利用Tissue DNA Kit(Omega)在轉(zhuǎn)染后48 h分別提取 PEI和電穿孔兩種方式轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組總DNA, 根據(jù)GenBank已公布的牛MSTN基因序列以及確定的靶點位置, 利用 Primer5.0設(shè)計引物Sense(5′-TGGAAAGGAAGTAGGCTGCTCAT-3′)和Antisense(5′-TTCTCCTGGTTCTGGGAAGGTTA-3′),以提取的全基因組DNA為模板, PCR擴(kuò)增目的片段。青鳉(Oryzias latipes)[10]、大鼠(Rattus norvegi cus)[11]、小鼠(Mus Musculus)[12]等模式動物的基因敲除研究中獲得了成功, 但是目前采用TALEN技術(shù)成功敲除大型家畜的報道還很少[13,14], 尚未見到成功獲得不含篩選標(biāo)記基因的牛突變細(xì)胞系的報道。本研究構(gòu)建了不含篩選標(biāo)記基因MSTN的兩個 TALENs真核表達(dá)載體, 獲得了穩(wěn)定敲除MSTN基因的牛胎兒成纖維細(xì)胞系, 為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因肉牛的育種研究提供材料。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性1 min, 63.2℃復(fù)性30 s, 72℃延伸1 min, 共35個循環(huán); 72℃延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并用凝膠回收試劑盒回收。PEI和電穿孔兩種轉(zhuǎn)染方式得到的PCR純化產(chǎn)物, 與pMD18-T克隆載體連接, 均挑10個單菌落送由北京英俊公司測序。

表1 牛MSTN基因的靶點信息

1.2.4 TALENs表達(dá)載體突變率的檢測

采用T7E1(NEB)檢測TALENs表達(dá)載體的突變效率。純化上述電穿孔和沒有轉(zhuǎn)染的PCR產(chǎn)物分別加緩沖液Buffer, 反應(yīng)條件：95℃10 min; 95℃～85℃(-2.0℃/s); 85℃ 1 min; 85℃～75℃(-0.3℃/s); 75℃ 1 min; 75℃～65℃(-0.3 ℃/s); 65℃ 1 min; 65℃～55℃(－0.3℃/s); 55℃ 1 min; 55℃～45℃(-0.3℃/s); 45℃1 min; 45℃～35℃(-0.3℃/s); 35℃ 1 min; 35℃～25℃(-0.3℃/s); 25℃ 1 min; 4℃保存; 上述反應(yīng)體系分別加入0.5 μL T7E1, 37℃反應(yīng)30 min后, 瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用灰度掃描軟件(BandScan5.0)根據(jù)突變率的計算公式(突變率=1-(1-切除片段所占百分比)0.5)進(jìn)行突變率的分析。

1.2.5 有限稀釋法制備單細(xì)胞克隆

將電轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞 300～500個稀釋至 100 mL含15% FBS的DMEM培養(yǎng)液中, 分別裝入20個100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中, 在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng), 48 h后換成新鮮的15% FBS的DMEM培養(yǎng)液和培養(yǎng)細(xì)胞24 h后的15% FBS的DMEM培養(yǎng)液, 每3 d換一次培養(yǎng)液。

1.2.6 MSTN突變細(xì)胞系的篩選

細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞克隆直徑生長至2 mm以上,用阿拉伯?dāng)?shù)字從 1開始分別對細(xì)胞克隆編號, 用牙簽刮取 1/3的細(xì)胞進(jìn)行酶切鑒定。剩下的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng), 至最小直徑長至4 mm以上, 消化、收集突變細(xì)胞將其凍存用于后續(xù)研究。牙簽刮取的細(xì)胞提取其基因組DNA, 通過PCR擴(kuò)增TALENs作用靶位點下游共計約612 bp片段, 經(jīng) SpeⅠ酶切鑒定是否存在突變, 將突變細(xì)胞系的 PCR擴(kuò)增片段純化, 與pMD18-T克隆載體連接, 每個細(xì)胞克隆均挑10個單菌落送由北京英俊公司測序。采用同源性分析軟件(DNAMAN)進(jìn)行序列比對, 分析確定突變類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 TALENs表達(dá)載體的活性檢測

分別利用 PEI和電穿孔方法將構(gòu)建好的TALENs表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞, 沒有轉(zhuǎn)染TALENs表達(dá)載體的細(xì)胞作為對照, 48 h后提取3種細(xì)胞基因組DNA, 通過PCR擴(kuò)增含靶位點、大小為612 bp的片段。經(jīng)測序分析：PEI轉(zhuǎn)染的10個細(xì)胞樣品中有1個樣品出現(xiàn)8 bp(AATAAACT)的堿基缺失; 電穿孔轉(zhuǎn)染的10個細(xì)胞樣品中有2個樣品出現(xiàn)堿基缺失, 大小分別為 7 bp(ACAATAA)和 10 bp(ATAAACTAGT)(表2)。

表2 MSTN基因突變的測序信息

2.2 TALENs表達(dá)載體突變效率的檢測

TALENs表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后提取基因組DNA, PCR擴(kuò)增后用T7E1酶切, 結(jié)果(圖1)表明：對照組只有一條帶, 表明沒有發(fā)生突變; 電穿孔轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組經(jīng) T7E1酶切后出現(xiàn)兩條帶, 說明基因組發(fā)生了突變, 突變率為20.4%。

圖1 T7E1鑒定結(jié)果M: DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); c: 對照組; 1: 電穿孔實驗組; 箭頭指突變型帶。

2.3 細(xì)胞克隆的制備及MSTN突變細(xì)胞系的篩選

為制備 MSTN基因敲除細(xì)胞系, 利用電穿孔方法將 TALENs表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞, 通過有限稀釋法獲得86個細(xì)胞克隆。采用酶切和測序的方法確定細(xì)胞克隆的突變類型。

用SpeⅠ分別單酶切每個克隆的PCR純化產(chǎn)物,沒有轉(zhuǎn)染 TALENs的細(xì)胞作為對照。結(jié)果表明, 14號克隆的PCR純化產(chǎn)物完全不能切開, 而對照組能完全切開, 15、23、29、31、34、36、39、40和43號克隆的PCR產(chǎn)物沒有完全被切開(圖2)。TALENs表達(dá)載體在牛胎兒成纖維細(xì)胞中介導(dǎo)產(chǎn)生的突變類型均為小片段缺失/插入突變(表3)。根據(jù)細(xì)胞克隆的堿基突變類型, 43號克隆不只出現(xiàn)一種基因型, 說明這種細(xì)胞克隆可能不是由單一細(xì)胞生長而來。TALENs表達(dá)載體在細(xì)胞克隆中介導(dǎo)MSTN基因的突變效率見表4。

依據(jù)PCR產(chǎn)物測序峰圖判斷單細(xì)胞克隆MSTN基因的突變情況, 從圖3的測序結(jié)果可以看出, 14號細(xì)胞克隆MSTN基因出現(xiàn)8 bp的堿基缺失(ctagtaaa)且只出現(xiàn)這一種基因型, 說明14號細(xì)胞克隆的靶位點發(fā)生了純合突變并且是由一個細(xì)胞生長而來。14號細(xì)胞克隆MSTN基因出現(xiàn)了8 bp的堿基缺失, 導(dǎo)致該缺失位點以后閱讀框移碼的改變, 終止密碼子提前出現(xiàn), 缺失了 183個氨基酸, 使能夠編碼成熟蛋白的 109個氨基酸缺失, 不能產(chǎn)生MSTN基因編碼的蛋白, 不能發(fā)揮應(yīng)有的生物活性, 導(dǎo)致骨骼肌數(shù)量增加。從細(xì)胞克隆(圖4)可以看出, 與未敲除的克隆相比, 14號克隆的細(xì)胞數(shù)量有所增加且細(xì)胞排列緊密, 細(xì)胞生長狀態(tài)良好。

圖2 突變克隆的酶切鑒定結(jié)果M: DL1500 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);“612 bp”指未切開的帶; 箭頭指示SpeⅠ切開的兩條帶。

表3 MSTN基因突變細(xì)胞克隆的靶序列信息

注：“－”表示缺失的堿基數(shù), “+”表示插入的堿基數(shù), “fs”表示讀碼框架發(fā)生改變。

表4 TALENs表達(dá)載體在細(xì)胞克隆中介導(dǎo)MSTN基因突變的效率

圖3 MSTN-/-型突變細(xì)胞克隆的測序峰圖左側(cè)下劃線表示左靶點TALE重復(fù)序列, 右側(cè)下劃線表示右靶點TALE的反向互補序列, 箭頭指向缺失堿基。

3 討 論

MSTN是研究?！半p肌”性狀時發(fā)現(xiàn)的一種負(fù)向調(diào)控骨骼肌生長的基因[16]。在某些哺乳動物中,該基因編碼區(qū)的突變可以增加肌肉量[17]。因此, 敲除MSTN基因可用于轉(zhuǎn)基因肉牛的育種。近年來, 新的基因敲除技術(shù)不斷涌現(xiàn), 如基因重組、鋅指核酸酶等, 其中TALEN技術(shù)近兩年取得尤為迅猛的發(fā)展。TALEN技術(shù)既有與ZFNs相同的特點, 如構(gòu)建簡單、可精確地修飾復(fù)雜的基因組等, 又有比 ZFNs毒性小、脫靶率低、易設(shè)計等優(yōu)點[18]。研究表明, 利用TALEN技術(shù)對不同序列平均每35 bp就可以設(shè)計一個TALEN靶向位置, 而ZFNs平均每500 bp才能設(shè)計出可實現(xiàn)基因打靶的位置, 證明TALEN技術(shù)更加優(yōu)于ZFNs[19,20]。

早在30年前, 傳統(tǒng)的基因重組技術(shù)就應(yīng)用于基因功能的研究, 到2011年已經(jīng)獲得70 754個干細(xì)胞系、6503個基因, 但是由于同源重組率低、易脫靶等原因, 很難獲得雙敲除的細(xì)胞克隆[21]。TALEN技術(shù)作為一種新的基因敲除技術(shù)在國內(nèi)外的研究報道很多, 但利用該技術(shù)對牛等大型家畜的報道還很少。2012年, Carlson等[14]直接用EGFP基因的mRNA和編碼TALENs的mRNA顯微注射到牛受精卵中, 這種方法雖然獲得了突變的受精卵, 但費用較高且無法用于轉(zhuǎn)基因肉牛的制備; 2013年, Xu等[13]利用含篩選標(biāo)記基因的TALENs對牛MSTN基因的功能進(jìn)行了研究, 但均未獲得不含篩選標(biāo)記基因MSTN-/-型的細(xì)胞克隆。本研究采用單元組裝法構(gòu)建的TALENs表達(dá)載體成本低且效率高, 獲得了不含篩選標(biāo)記基因MSTN-/-型的細(xì)胞克隆。后續(xù)仍需提高轉(zhuǎn)染效率, 以期獲得更多高效 MSTN-/-型的細(xì)胞系, 為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因牛的育種提供材料。

轉(zhuǎn)基因動物育種常利用抗性標(biāo)記基因和藥物篩選制備基因修飾細(xì)胞, 但含抗性基因的轉(zhuǎn)基因動物作為食品具有潛在的風(fēng)險。本研究獲得的 10個MSTN基因敲除細(xì)胞克隆(包括 MSTN-/-和 MSTN+/-)不含有任何篩選標(biāo)記基因, 可為高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因肉牛的育種提供優(yōu)質(zhì)材料。同時, 本研究篩選 MSTN基因突變細(xì)胞系的方法是直接取部分細(xì)胞進(jìn)行酶切鑒定, 結(jié)果正確后測序, 這樣就免去了將細(xì)胞系接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中的傳代過程, 減少了單細(xì)胞克隆在體外傳代的次數(shù)。因此, 本研究采用的方法可大幅度縮短時間, 提高工作效率, 減少單細(xì)胞克隆體外培養(yǎng)的時間, 更加有利于轉(zhuǎn)基因育種的研究。

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(責(zé)任編委: 張 博)

Myostatin knockout in bovine fetal fibroblasts by using TALEN

Cuicui Yang, Huili Tong, Xinghong Ma, Wei Du, Dan Liu, Yu Yang, Yunqin Yan

College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

Myostatin (MSTN) can negatively regulate the growth and development of skeletal muscle, and mutations of bovine MSTN gene can cause a “double-muscle” feature. To knock out MSTN gene in bovine fetal fibroblast by transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and obtain MSTN knockout cell lines, we constructed one pair of MSTN-TALEN vector and transfected into bovine fetal fibroblast cells by PEI and electroporation. Sequencing results demonstrated that TALEN was available for MSTN knockout. T7 endonuclease 1 (T7E1) was used for the detection of mutation efficiency. The results indicated that knockout efficiency of electroporation transfection was 20.4%, and 10 MSTN+/-and MSTN-/-cell colonies were obtained via limiting dilution method. The deletion number of nucleotides ranged from 1 to 20, and some of them were frameshift mutation, which could provide the possibility in production of MSTN knockout cattle in the future.

TALENs; bovine; Myostatin; knockout; transfection

2013-12-16;

2014-03-29

國家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?編號：2011ZX08007-002)資助

楊翠翠, 碩士, 專業(yè)方向：分子克隆與基因敲除。E-mail: 806344748@qq.com

嚴(yán)云勤, 教授, 博士生導(dǎo)師, 研究方向：轉(zhuǎn)基因動物。E-mail: yanyunqin@sohu.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0685

時間: 2014-6-4 16:11:41

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140604.1611.001.html