吳楠,王丕武,李丹,代力強,鄭成忠,盧實,才源,張卓,曲靜,夏海豐,2

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,長春 130118;

2. 通化市農(nóng)業(yè)科學研究院,梅河口 135000

大豆苷元是大豆異黃酮(Soybean Isoflavone)的主要成分之一[1],在大豆(Glycine max)苗期胚軸中含量最高,可達到異黃酮含量的 30%; 同時也是大豆中重要的生理活性物質,可以提高大豆對致病菌類微生物的抗性[2,3]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明,大豆苷元同樣可以調(diào)節(jié)人體的多項生理功能,具有預防和治療心腦血管疾病、預防乳腺癌和激素依賴性腫瘤[4]以及骨質疏松[5]和雌激素樣[6]等。因此,利用分子生物學手段研究大豆苷元合成及調(diào)控具有重要的意義。

查爾酮還原酶 (Chalcone reductase,CHR)是大豆苷元合成的關鍵酶之一。CHR能與查爾酮合成酶(Chalcone synthesis,CHS)聯(lián)合作用催化合成異甘草素[7],其是合成大豆苷元必要的前體化合物。劉江等[8]從栽培大豆中克隆得到第14號染色體上一個編碼大豆查爾酮還原酶的 GmCHR,并通過與豆科中其他查爾酮還原酶基因相比可知,CHR在豆科植物基因組中以多基因形式共同存在,并能夠聯(lián)合調(diào)節(jié)合成異甘草素,因此,對不同類型的 CHR進行分析有助于明確其在催化過程中的效率及相互調(diào)控關系。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指利用小的雙鏈RNA高效特異阻斷特定基因的表達,使其在轉錄后水平上促使mRNA降解,達到基因沉默的效果,進而確定該基因的功能。本文構建了大豆查爾酮還原酶基因1(CHR1)的RNAi植物表達載體[9]并轉化大豆,通過對轉基因大豆中 CHR1的表達量及其催化產(chǎn)物的檢測,分析 CHR1對大豆苷元合成的影響,初步驗證 CHR1的催化功能與效率,為利用轉基因技術提高大豆苷元含量、改良大豆的抗病性[10]提供了理論依據(jù),并為 CHR1在基因工程中的高效利用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

大豆種子吉農(nóng)28、大腸桿菌DH5α菌株、農(nóng)桿菌EHA105菌株、克隆重組載體pMD18-T-CHR1、表達載體pCPB、克隆載體 pMD18-T均由吉林農(nóng)業(yè)大學植物生物技術中心提供與保存。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的獲得

以已知CHR1(GenBank登錄號：X55730.1)的重組克隆載體pMD18-T-CHR1質粒為模板,利用特異性引物CZS/CZAS和CFS/CFAS(序列見表1,由北京三博遠志生物公司合成)擴增得到目的片段,測序后在NCBI上進行序列比對,該基因含有兩個內(nèi)含子。本研究選擇該基因帶有內(nèi)含子的序列擴增正、反義片段,大小404bp,其中正反義各323bp,內(nèi)含子81bp,用于形成莖環(huán)結構。

PCR擴增體系為 25μL,包括：2.5μL MgCl2,2.5μL Buffer,1μL 特異性引物 CZS/CZAS 或CFS/CFAS(表 1),1μL 模板,0.5μL dNTP,0.2μL Taq聚合酶(PCR擴增試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品),無菌水補充至25μL。擴增條件：94℃預變性10 min; 94℃變性45 s,51℃復性45 s,72℃延伸45 s,35個循環(huán);最后再72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,回收(DNA凝膠回收試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品)后與 pMD18-T載體連接,獲得重組克隆載體pMD18-T-CHR1并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞 DH5α,挑取單克隆菌落,提取質粒后由北京三博遠志生物技術公司進行測序。

1.2.2 RNA干擾表達載體的構建

PCR擴增帶有內(nèi)含子的正反義片段,擴增產(chǎn)物經(jīng) 1%的瓊脂糖凝膠電泳,回收純化目的片段并將正義片段與基礎表達載體 pCPB同時用 XbaI和BamHⅠ(限制性內(nèi)切酶為TaKaRa公司產(chǎn)品)進行雙酶切,回收載體和正義片段,按體積比為 1:3進行連接,連接體系如下：12μL目的片段,4μL載體,1μL T4 連接酶,2μL T4 Buffer,1μL ddH2O。22℃反應過夜。此時得到的載體命名為pCPB-Z。

表1 引物信息

圖1 RNA干擾載體結構圖

采用同樣的方法,用 SacⅠ和 BamHⅠ雙酶切,將反義片段連接入 pCPB-Z載體中,得到以抗除草劑 Bar基因為篩選標記的 RNA干擾表達載體pCPB-CHR1-RNAi。對該載體進行PCR檢測及雙酶切鑒定。載體構建圖如圖1所示。

1.2.3 大豆的遺傳轉化

本文采用農(nóng)桿菌侵染大豆子葉節(jié)方法[11,12]將構建好的pCPB-CHR1-RNAi的質粒DNA轉入受體大豆品種“吉農(nóng)28”中,并獲得轉化植株。

1.2.4 轉基因植株的后代檢測

1.2.4.1 PCR檢測 按抗除草劑基因Bar(552bp)、啟動子35S(500bp)的基因序列分別用primer 5.0軟件設計引物BarS/BarAS和35S/35AS(表1)。取幼嫩轉化大豆植株葉片,用 CTAB法[13,14]提取基因組并進行PCR檢測,并以未轉化的受體大豆葉片基因組作為陰性對照。Bar基因的PCR擴增體系為25μL,擴增條件為：94℃預變性5 min; 94℃變性40 s,60℃復性40 s,72℃延伸40 s,30個循環(huán); 最后72℃再延伸8 min,4℃保存。35S基因的PCR擴增體系為25μL,擴增條件為：94℃預變性5 min; 94℃變性30 s,55℃復性30 s,72℃延伸30 s,40個循環(huán); 最后72℃再延伸8 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將目的片段回收并測序。

1.2.4.2 轉基因植株的Southern blotting檢測 提取 PCR檢測為陽性的 T1代轉化植株葉片的基因組DNA,用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ 酶切,以純化的 35S作為探針,使用 DIG DNA Labeling and Detection Kit I試劑盒(羅氏公司產(chǎn)品),按照說明書標記探針,制備樣品、轉膜、雜交、洗膜、染色顯影等程序,進行Southern blotting檢測。

1.2.4.3 轉基因植株的熒光定量PCR檢測 提取經(jīng) Southern blotting檢測出現(xiàn)陽性信號的轉基因植株的葉片RNA,反轉錄得到cDNA,5倍稀釋后待用。設計熒光定量PCR引物QCHR1和QACHR1(表1)。選擇大豆肌動蛋白 β-actin基因(GenBank登錄號:NM_001252731.2)為內(nèi)參基因,設計定量 PCR引物QFACT和QRACT(表1)。利用Mx 3000P熒光定量PCR儀(吉泰生物科技公司產(chǎn)品)對大豆葉片組織總RNA進行分析[15,16]。按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明操作(TaKaRa公司產(chǎn)品),PCR擴增體系為 25μL：2×SYBR Premix Ex Taq 聚合酶 12.5μL,QCHR1 引物 1μL,QACHR2 引物 1μL,模板 2μL,無菌水補至25μL。兩步法PCR擴增條件：95℃預變性3 min; 95℃變性10 s,60℃反應35 s,40個循環(huán)。根據(jù)公式計算:

分析目的基因的相對表達量。

1.2.5 CHR1基因表達產(chǎn)物異甘草素的測定

利用高效液相(HPLC)對異甘草素的含量進行測定,高溫干燥處理轉化的大豆葉片組織并選擇同品種未轉化的大豆植株葉片作為對照,各稱取干重0.5 g,用液氮研磨至細小粉末狀并溶于的甲醇溶液中(4:1,體積比),超聲波處理進一步破壞葉片組織(40℃,50 min,功率顯示70%)之后浸泡過夜。過濾除去不溶的雜質,蒸發(fā)脫去萃取溶液中的溶劑,再加入乙醋酸鹽緩沖液充分溶解提取物,使溶液 pH值穩(wěn)定在5,同時加入適量的纖維素酶,37℃條件下反應過夜,確保除去所有修飾異甘草素糖苷的糖基。然后采用乙酸乙酯進行萃取酶水解液中的配基異甘草素,再將乙酸乙酯萃取。樣品溶解于甲醇溶液中,用0.22μm有機濾膜抽濾,上樣量為20μL,進行高效液相色譜定量分析[19,20]。

2 結果與分析

2.1 大豆查爾酮還原酶基因CHR1正反義片段的克隆和RNA干擾表達載體構建

以本實驗室已克隆的pMD18-T-CHR1質粒為模板,利用其特異性引物 CZS/CZAS和 CFS/CFAS(表1)分別擴增帶有內(nèi)含子的正反義片段,擴增片段長度為404bp,其中正反義片段各323bp,內(nèi)含子81bp; 將擴增片段重組到pCPB,構建成干擾表達載體pCPB-CHR1-RNAi。XbaⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定得到404bp帶有內(nèi)含子的正義片段,BamHⅠ/SacⅠ雙酶切得到404bp帶有內(nèi)含子的反義片段。

2.2 T1代轉基因植株的獲得及檢測

2.2.1 T1代植株的PCR檢測

將pCPB-CHR1-RNAi干擾載體轉入受體大豆品種“吉農(nóng) 28”中,經(jīng) PCR檢測得到 4株 T0代陽性植株。收獲 T0代種子37粒,室內(nèi)種植后得到T1代植株,提取基因組DNA,利用抗除草劑 Bar基因和35S基因的特異性引物進行 PCR檢測,以重組表達載體 pCPB-CHR1-RNAi的質粒 DNA為陽性對照,未轉化的受體大豆植株作為陰性對照,檢測結果如圖2所示。

由圖2可知,從T1代轉基因植株中擴增出的條帶與目標基因大小一致(552bp,500bp),初步證明外源基因已整合進大豆基因組中,PCR擴增結果顯示T1代共獲得13株轉基因陽性植株。

2.2.2 T1代陽性植株的Southern blotting檢測

圖2 T1代陽性植株抗除草劑Bar及35S的檢測

分別提取PCR陽性植株的基因組DNA,用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ酶切,以35S為探針,進行Southern blotting檢測。如圖 3所示,未轉化植株沒有出現(xiàn)雜交信號,檢測的轉基因植株中有 3株出現(xiàn)明顯的雜交信號,共獲得7株經(jīng)Southern blotting檢測為陽性的植株。表明功能元件以單拷貝的形式整合到受體大豆基因組中,但整合位點不相同。

圖3 T1代轉基因植株Southern雜交檢測

2.2.3 T1代轉基因植株熒光定量PCR檢測

以SYBR Green I為染料,經(jīng)Southern blotting檢測為陽性的轉基因植株進行qRT-PCR檢測。如圖4所示,轉基因大豆植株中CHR1基因mRNA的相對表達量與受體植株相比有明顯的差異,且不同轉化植株間CHR1基因的表達變化量差異也較大。2～8號轉基因植株的干擾效率分別為：97.88%、98.09%、78.02%、98.33%、65.78%、56.98%、91.76%,其中5號植株干擾效率最高。

2.3 T1代轉基因植株異甘草素含量的測定

對 CHR1調(diào)控的代謝產(chǎn)物異甘草素的含量進行檢測,通過 HPLC檢測 5號轉化大豆植株異甘草素的含量。如圖 5所示,轉化植株葉片組織中異甘草素的含量為 0.979μmol/g,未轉化植株異甘草素的含量為1.597μmol/g,其含量降低了38.7%。

圖4 CHR1基因相對表達量

2.4 CHR1基因編碼蛋白的預測

根據(jù) EsPASy和 InterPro的分析結果,預測CHR1基因編碼含有315個氨基酸殘基的蛋白產(chǎn)物,分子量為 35489.8 Da,理論等電點 pI=6.32。根據(jù)CHR1的氨基酸序列分析可知,在49～66和152～169處含有兩個阿爾多/酮(AIdo/keto)還原酶家族的特征性催化位點(Aldo/keto reductase family signature 1 and Aldo/keto reductase family signature 2),在262～277處含有一個阿爾多/酮(AIdo/keto)還原酶家族可能的特征性活性結合位點(Aldo/keto reductase family putative active site signature),預示該蛋白可能屬于阿爾多/酮(AIdo/keto)還原酶蛋白。同時構建CHR1基因表達產(chǎn)物結構圖(圖6),含有典型的特征性的阿爾多/酮(AIdo/keto)還原酶催化位點的折疊結構,進一步證明了CHR1基因表達產(chǎn)物的催化功能。

圖5 異甘草素HPLC檢測圖

3 討 論

研究顯示,查爾酮還原酶是由多基因家族組成的[21,22],對于不同的CHR基因的功能和效率、相互之間的關系,需要進一步深入的研究。Shimada等[23]從百脈根中克隆出與查爾酮還原酶同源的聚酮還原酶基因,在牽?；ㄖ羞^表達,證明其促進異甘草素的形成。Xu等[23]對蒙古黃芪AmCHR進行克隆,結果表明AmCHR在根、莖、葉中均有表達,在根中優(yōu)勢表達。劉江等[23]從栽培大豆南農(nóng)1138-2中克隆出GmCHR序列,構建過表達載體并對大豆進行遺傳轉化,通過組織表達分析結果顯示,GmCHR在大豆葉片中表達量最高。本研究結果顯示,CHR1基因在大豆的葉片部位的表達量最高,其次為根部。

圖6 CHR1基因表達產(chǎn)物的3D立體結構預測圖

利用農(nóng)桿菌介導法將功能元件轉入受體大豆基因組中,Southern blotting檢測說明功能元件以單拷貝形式整合到大豆基因組當中,熒光定量PCR檢測CHR1基因 mRNA的表達量,最高下降98.33%,而HPLC檢測 CHR1調(diào)控的代謝產(chǎn)物異甘草素的含量僅下降38.7%,可能的原因有待進一步研究。

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