史鳳陽,高芳鑾,沈建國,常飛,詹家綏

1.福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所,福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350002;2.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,福州 350001

病原物群體遺傳變異及其演化機(jī)制直接影響植物病害的發(fā)生、發(fā)展及控制。在寄主、病原和環(huán)境的病害三角中,病原物承受著來自寄主和環(huán)境的雙重選擇。為了增加對(duì)新的抗病寄主和新環(huán)境的適應(yīng)性,病原物通過突變、基因流和基因重組不斷引進(jìn)和產(chǎn)生新的變異。在自然選擇下,有益變異得到積累,有害變異則被淘汰[1]。由于寄主和病原物本身都是由復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的個(gè)體組成的,隨著病原物群體結(jié)構(gòu)的時(shí)空變化,這種特定的寄主——病原物關(guān)系也隨之發(fā)生改變。馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是目前感染馬鈴薯并造成最嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的病毒之一。PVY寄主范圍廣,在全球馬鈴薯種植區(qū)廣泛流行,在我國馬鈴薯種植區(qū)及亞洲地區(qū)周邊國家也普遍發(fā)生,并呈上升發(fā)展趨勢[2,3]。PVY是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的重要成員之一[4],其基因組由正單鏈RNA分子組成,大小約 10 kb,包含一個(gè)大的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)。PVY基因組采用多聚蛋白切割(Polyprotein cleavage)和移碼翻譯(Read frame shift)方式最終生成 11個(gè)成熟的多功能蛋白[5,6],使該病毒呈現(xiàn)不同程度的遺傳多樣性。根據(jù)是否發(fā)生基因重組,PVY株系分為兩大類：一類是非重組株系,包括PVYO、PVYC和 PVYN株系; 另一類是PVYO和PVYN在不同基因區(qū)段發(fā)生重組的株系,即 N×O重組株系,如：PVYNTN、PVYN-Wi(北美稱 PVYN:O)、PVYNTN-NW[7,8]。由于N×O重組株系具備了非重組株系的其他適應(yīng)性優(yōu)勢,表現(xiàn)出比PVYO株系和PVYN株系更強(qiáng)的致病力,如：PVYNTN株系侵染馬鈴薯后,可以引發(fā)馬鈴薯塊莖環(huán)斑壞死病(Potato tuber necrotic ringspot disease,PTNRD),導(dǎo)致馬鈴薯種質(zhì)退化、產(chǎn)量降低。目前,PVY重組株系已在全球的不同地區(qū)蔓延[9]。由于 PVY群體遺傳多樣性高,株系分化嚴(yán)重,具有相對(duì)強(qiáng)的生存和進(jìn)化優(yōu)勢,可以快速適應(yīng)新寄主(或生存環(huán)境)。隨著近年來農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易的全球化,PVY變異頻繁,不斷有新的重組株系產(chǎn)生,對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)造成極大損失[10],嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)高達(dá)80%以上[11]。因此,開展PVY功能基因的分子多樣性研究有利于探索變異、重組等遺傳機(jī)制在PVY進(jìn)化中的作用,也有助于了解植物病毒的發(fā)生、流行和防控特點(diǎn),具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

對(duì)于P1基因的研究側(cè)重于蛋白質(zhì)組學(xué)、生物化學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方面[12],在群體遺傳學(xué)領(lǐng)域,P1基因的研究多局限于對(duì)遺傳多樣性的描述,對(duì)該基因分子變異、P1蛋白3D結(jié)構(gòu)的影響及遺傳多樣性形成的遺傳機(jī)制研究較少。如：吳興泉等[13]比較了 1個(gè)福建分離物與其他已發(fā)表的33個(gè)分離物的P1蛋白氨基酸序列同源性,發(fā)現(xiàn)氨基酸序列在不同分離物之間存在明顯差異; Hu 等[14]研究表明,PVY全基因組存在5個(gè)顯著的重組熱點(diǎn),其中P1基因可能是重組的熱點(diǎn)區(qū)之一; Wang等[15]通過分析煙草上的兩個(gè)山東PVY分離物AQ4和FZ10的分子特征,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)分離物的P1基因均為N×O重組型; 張俊祺等[16]對(duì)煙草上一個(gè)貴州PVY分離物的P1基因進(jìn)行了克隆和序列分析,表明該分離物的變異來自堿基位點(diǎn)的突變而非基因重組。以上發(fā)現(xiàn)雖然為了解PVY進(jìn)化奠定了基礎(chǔ),但許多結(jié)果還沒有得到其他數(shù)據(jù)的有效驗(yàn)證。

福建省是中國最早種植馬鈴薯的地區(qū)之一,也是南方馬鈴薯冬種的優(yōu)勢區(qū)和主產(chǎn)區(qū)。對(duì)于福建省PVYP1基因遺傳多樣性及其形成的遺傳機(jī)制與我國乃至世界其他地區(qū)PVYP1基因的異同性尚未有系統(tǒng)的報(bào)道。為此,本文在前期檢測的53份福建省PVY陽性樣品中[3],對(duì)采自福州、寧德、龍巖、漳州4個(gè)地區(qū)各3個(gè)樣品,通過克隆獲得的12個(gè)PVY分離物P1基因的全長 cDNA序列,并應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)其核苷酸序列、氨基酸序列的分子變異及結(jié)構(gòu)特征等開展系列分析,旨在探索福建PVYP1基因的遺傳變異特征以及明確突變和重組等遺傳機(jī)制在該基因進(jìn)化的作用,為PVY病毒病的流行、變異趨勢及其有效防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

馬鈴薯病株于2011年～2012年之間采自福建省馬鈴薯主要種植區(qū),在前期研究共檢測到的 53份PVY陽性樣品中[3],分別從福州、寧德、龍巖、漳州 4個(gè)地區(qū)采用隨機(jī)抽樣法各抽取 3個(gè)樣品,共計(jì)12個(gè)福建分離物用于本研究。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及P1基因克隆

采用 Trizol 試劑法從感染 PVY的馬鈴薯病葉中提取總 RNA,提取方法參照 RNA Simple Total RNA 試劑盒(TianGen)說明書進(jìn)行。取2 μL 總RNA用 oligo(dT)18為引物按照操作說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得 PVY全長的 cDNA。根據(jù) GenBank已報(bào)道的PVY常見株系P1基因序列保守區(qū),設(shè)計(jì)一對(duì)用于擴(kuò)增該基因的簡并引物 P1-F(5′-CVATGGCAAYYTACAYGTCAAC-3′)和 P1-R(5′-AGGRTATCTCADYHGTGCCC-3′),預(yù)期片段大小為 915 bp,引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

PCR 擴(kuò)增采用 25 μL 反應(yīng)體系:10×TransTaqHiFi Buffer II 2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL,P1-F(10 μmol/L)1 μL,P1-R(10 μmol/L)1 μL,ddH2O 34.5 μL,TransTaqHiFi Polymerase(5 U/μL) 0.5 μL,cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,53℃復(fù)性30 s,72℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán); 最后一輪循環(huán)后72℃延伸5 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后,取產(chǎn)物5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后與 pEASY-T5 Zero 克隆載體連接,并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。篩選得到陽性克隆子,隨機(jī)選擇其中3～6個(gè)由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序列,并根據(jù)測序峰圖及序列比對(duì)分析排除由PCR擴(kuò)增引起的突變。

1.2.2P1基因的分子變異

測序獲得的序列使用 DNAMAN等軟件進(jìn)行處理,P1基因的核苷酸使用 MEGA軟件中的 Muscle(Codons) 子程序進(jìn)行多重比對(duì),并根據(jù)對(duì)應(yīng)的編碼氨基酸序列進(jìn)行校正。序列同源性使用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)工具在線比對(duì),分子變異通過DnaSP、MEGA5等軟件進(jìn)行分析。

1.2.3P1基因的重組分析

以文獻(xiàn)報(bào)道的PVY 分離物 Oz(EF026074) 和Mont(AY884983)作為參考親本株系[14],并以分離物N-605 作為備選參考株系[2]。使用SimPlot 3.5進(jìn)行潛在重組事件的相似性作圖(Similarity plot)和Bootscanning分析[17]。使用遺傳算法重組檢測法(Genetic Algorithm Recombination Detection,GARD)進(jìn)行重組位點(diǎn)的檢測并評(píng)估重組點(diǎn)的可靠性[18]。

1.2.4P1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為進(jìn)一步了解 PVYP1基因的分子進(jìn)化,從GenBank中選取20個(gè)已知株系的PVYP1基因序列作為參考(表1),使用貝葉斯法(Bayesian inference,BI)進(jìn)行PVYP1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析。建樹前,使用 MAFFT[19]軟件對(duì)建樹的 32條P1基因序列進(jìn)行多重序列比對(duì),利用Mrmodeltest[20]選擇最優(yōu)化的進(jìn)化模型—GTR+I模型。使用 Mrbayes3.04 b[21]進(jìn)行BI法分析時(shí),根據(jù) Mrmodeltest的 AIC(akaike information criterion)標(biāo)準(zhǔn),替換模型為nst = 6,位點(diǎn)間變異速率設(shè)置為rates = propinv,建立4個(gè)馬爾可夫鏈,以隨機(jī)樹為起始樹,共運(yùn)行2 000 000代。每100代抽樣1次,舍棄25%老化樣本后,根據(jù)剩余的樣本構(gòu)建一致樹,并計(jì)算后驗(yàn)概率(Posterior probability)。

1.2.5 P1蛋白的序列特征

通過 ExPASy的 ProSITE數(shù)據(jù)庫(http:// prosite.expasy.org/)搜索P1蛋白中可能存在的Motif。為確保重要信息不被遺漏,避免發(fā)生單一數(shù)據(jù)庫中不能被檢測到的錯(cuò)誤,Motif搜索時(shí),聯(lián)網(wǎng)至Profile數(shù)據(jù)庫(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/jj/pfscan2.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列輪廓搜索(Profile Search); 通過 COILS Server(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)分析P1蛋白是否含有卷曲螺旋(Coiled-coil,CC)結(jié)構(gòu); P1蛋白的結(jié)構(gòu)功能域通過SMART4.0服務(wù)器搜索; P1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)通過 I-TASSER在線服務(wù)器(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu)進(jìn)行預(yù)測。

表1 PVY參考序列及其GenBank登錄號(hào)

2 結(jié)果與分析

2.1 P1基因的序列分析

使用簡并引物P1-F/P1-R擴(kuò)增到P1基因的PCR產(chǎn)物與預(yù)計(jì)的目的片段大小一致,約 915 bp(圖1),12個(gè)分離物及陽性對(duì)照均擴(kuò)增到目的片段,陰性(健康馬鈴薯葉片)和空白對(duì)照均未擴(kuò)增到相應(yīng)的片段。

RT-PCR擴(kuò)增到的目的片段克隆、測序后經(jīng)DNAMAN、BLAST等分析,確定目的基因片段大小為 915 bp,其中1～825 bp為PVY P1蛋白(First protein)的編碼基因序列(GenBank登錄號(hào)分別為 KF722800、KF722802、KF722806、KF722808、KF722809、KF722811、KF722814、KF722819、KF722826、KF722828、KF722831和KF722833),編碼275個(gè)氨基酸的P1蛋白。序列同源性分析顯示,福建 12個(gè) PVY分離物P1基因與8個(gè)PVY不同株系參考核苷酸序列一致性為 73%～99%(表 2),其中分離物 XT04、LH14、LH21、LY08、LY35、XQ04、ZL02與Oz的序列一致性最低(73%～74%),與 Mont、HN1、Mb112、Wilga5、HN2的序列一致性最高(98%～99%); 分離物 QK44、XT02、XT08、LH05與 Wilga5的序列一致性最高(95%～99%),而與其他分離物的一致性為77%～90%;分離物L(fēng)Y30與Oz的序列一致性最高(99%),而與其他分離物序列一致性均不高(74%～84%)。通過DNAMAN分析可知,福建分離物P1序列之間核苷酸序列一致性為 73%～99%。一致性分析結(jié)果表明,P1基因在福建不同分離物之間存在較大差異。

圖1 福建分離物P1基因RT-PCR擴(kuò)增

翻譯后的 P1蛋白存在 85個(gè)(占 31%)變異的氨基酸位點(diǎn),其中 LY08、LY35、XT02和 XT08分離物各有一個(gè)特異性的氨基酸變異位點(diǎn),ZL02分離物含有兩個(gè)特異性的氨基酸變異位點(diǎn),LH05分離物有4個(gè)特異性的氨基酸變異位點(diǎn),而LY30分離物則有30個(gè)特異性的氨基酸變異位點(diǎn),顯示出與其他分離物顯著的差異(表3)。

表2 PVY不同分離物P1基因核苷酸序列一致性(%)

表3 福建省PVY分離物P1基因特異氨基酸突變位點(diǎn)

2.2 P1基因的重組分析

通過Simplot軟件分析(圖2:A和B),發(fā)現(xiàn)分離物 QK44、XT02、XT08、LH05中均檢測一個(gè)潛在的重組信號(hào),表明分離物QK44、XT02、XT08、LH05的P1基因序列可能是PVYN和 PVYO的重組而成。進(jìn)一步通過GARD 確認(rèn)這4個(gè)分離物存在兩個(gè)重組位點(diǎn)(圖2C)：(1)309位核苷酸的重組位點(diǎn)平均模型支持率達(dá)99.32%,且KH檢驗(yàn)顯示P= 0.0040 < 0.01;(2)423位核苷酸的重組位點(diǎn)的平均模型支持率為36.52%,且KH檢驗(yàn)顯示P= 0.0040 < 0.01。

2.3 P1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

重建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示(圖3A),在PVY基因組的P1基因區(qū)段上,相同株系型的分離物以較高的置信值優(yōu)先相聚成簇,福建分離物12個(gè)分離物形成3個(gè)簇,LY30分離物與O株系型(O Clade)的Oz、SASA110分離物聚為一簇(Cluster 3),QK44、XT02、XT08、LH05分離物與 N×O 重組型(N×O Clade)的SYR-II-2-8、3401、Wilga5等分離物聚為一簇(Cluster 2),而其他的7個(gè)分離物與N株系型(N Clade)的分離物聚為一簇(Cluster 1)。

2.4 P1蛋白的結(jié)構(gòu)特征

COILS Server分析結(jié)果顯示,12個(gè)PVY福建分離物中,XT04、LH14、LH21、LY08、LY35、XQ04、ZL02分離物P1蛋白的70～98位氨基酸之間均檢測到一個(gè)明顯的卷曲螺旋 CC domain(圖 3B),而其他分離物也在相似位置檢測到 CC domain,但置信值不高。

通過 SMART服務(wù)器搜索,發(fā)現(xiàn) P1蛋白第41～275氨基酸是一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域—Peptidase_S30,為PotyvirusP1 protease家族成員共有的典型結(jié)構(gòu)域。P1蛋白的C′端區(qū)域是一類催化裂解 P1/HC-pro蛋白的絲氨酸蛋白酶(Serine-type protease),Petpidase_S30主要由多個(gè)Potyvirus的P1蛋白的C′端區(qū)域組成。雖然PVY不同分離物的P1蛋白氨基酸序列差異較大,進(jìn)一步通過 Motif搜索發(fā)現(xiàn) P1蛋白內(nèi)存在 7個(gè)保守的 Motif：I-x-F-G、V-E-L-I、I-S-I-x-G-G、F-L-x-G、H-x(8)-D/E、G-x-S-G和R-G,其中Motif H-x(8)-D/E和G-x-S-G包含絲氨酸蛋白酶Peptidase_S30的3個(gè)活性位點(diǎn)(H192、D201、S235)(圖 4:A 和 C)。

圖2 重組的檢測和驗(yàn)證

圖3 分支間的P1基因的特征比較

圖4 P1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

I-TASSER服務(wù)器返回 P1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示12個(gè)福建分離物的P1蛋白存在3種不同的空間結(jié)構(gòu),經(jīng)PyMOL渲染后如圖3C所示,其中分離物 XT04、LH14、LH21、LY08、LY35、XQ04、ZL02的P1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)為N Clade型; 分離物QK44、XT02、XT08、LH05的P1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)為N×O Clade型; LY30分離物的P1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)為O Clade型。N Clade型和O Clade 型的P1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)較為接近,但是N×O Clade型的P1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與前兩者差別大(圖4B),且P1蛋白的3個(gè)活性位點(diǎn)(H192、D201和S235)在空間上相距較遠(yuǎn)。

3 討 論

3.1 P1基因的遺傳變異及分子進(jìn)化

高度變異性是RNA病毒的典型特征之一,主要由于依賴 RNA 的 RNA 聚合酶(RdRp)或復(fù)制酶缺乏校正功能,使得 RNA病毒具有非常高的突變率(約為 10-4個(gè)核苷酸/復(fù)制循環(huán)),這也是 RNA 病毒的一種進(jìn)化策略[22,23]。前人研究表明,P1蛋白不論在長度及氨基酸序列上是所有Potyvirus中分化最明顯的一個(gè)蛋白[24]。ICTV報(bào)告規(guī)定同一種病毒的全基因組核苷酸序列的同源性不低于85%,3′端非編碼區(qū)序列同源性不低于75%,CP蛋白的氨基酸序列同源性不低于80%[4]。PVY福建分離物P1基因具有高度的變異性,12個(gè)不同分離物P1基因之間以及與已知株系的其他分離物核苷酸序列一致性均在 73%～99%之間(表 2),已跨越了Potyvirus劃分種的序列一致性閾值[4],Valli等[24]認(rèn)為PotyvirusP1基因的高度變異性與其適應(yīng)不同的寄主密切相關(guān)。

在Potyvirus中,基因重組是病毒進(jìn)化的一個(gè)重要機(jī)制[25],通過基因重組可以產(chǎn)生大量的遺傳變異,這遠(yuǎn)比僅僅由突變造成的變異來得更快[26]。除了高突變率外,基因重組在 PVY 基因組中也頻繁發(fā)生。Simplot和 GARD重組分析結(jié)果,顯示福建分離物QK44、XT02、XT08、LH05分離物的P1基因存在明顯的基因重組現(xiàn)象,即由PVYN和PVYO株系在P1基因區(qū)段不同位置發(fā)生重組(圖2)。在4個(gè)分離物中,GARD檢測到兩個(gè)重組位點(diǎn)(309 nt和423 nt),其中 309 nt的重組位點(diǎn)平均模型支持率達(dá)99.32%,經(jīng)KH檢驗(yàn)極其顯著(P< 0.01),表明該位點(diǎn)為福建分離物P1基因重組位點(diǎn)的置信度非常高。綜合P1基因的分子變異分析結(jié)果,表明福建分離物P1基因的變異主要源自堿基位點(diǎn)的突變和基因重組,說明兩者在 PVY進(jìn)化中起著重要的作用,是 PVY新株系不斷形成的主要因素。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示(圖3A),PVYP1基因分化明顯,12個(gè)福建分離物形成3種不同的大簇,故而單獨(dú)使用P1基因序列為分子標(biāo)記進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,無法對(duì) PVY 重組株系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定,如圖 3A 中HN1分離物(PVYNTN株系)和 HN2分離物(PVYNTN-NW株系),兩者分屬不同的株系,但因在P1基因區(qū)段上均為 N株系型(N Clade)而聚為一簇(Cluster 1)。當(dāng)筆者聯(lián)合P1和CP基因分析顯示,12個(gè)福建分離物中僅 LY30為 PVYO株系,而其他11個(gè)福建分離物均為 N×O重組株系(未發(fā)表數(shù)據(jù)),表明重組株系已成為福建PVY的主流。因此,生產(chǎn)中需要密切關(guān)注這些分離物的發(fā)展動(dòng)態(tài)。

3.2 P1蛋白的結(jié)構(gòu)特征

CC domain是蛋白質(zhì)中一類特殊的α螺旋鏈互相纏繞形成的平行或反平行同寡聚體或異寡聚體結(jié)構(gòu)的總稱,是控制蛋白質(zhì)寡聚化的元件[27]。前人研究表明,CC domain 在病毒復(fù)制、致病性以及增強(qiáng)病毒RNA沉默抑制子(Viral suppressor of RNA silencing,VSR)活性中起著重要的作用[28～30]。P1基因位于PVY基因組的起始位置,編碼絲氨酸蛋白酶(P1 peptidase),是病毒基因復(fù)制中的一個(gè)輔助因子,在致病性和增強(qiáng)VSR等方面也起著重要的作用[31～33]。通過Coiled-coil server分析結(jié)果顯示,N Clade型的分離物含有典型的CC domain,而O Clade型和N×O Clade型分離物的CC domain則不明顯,這可能是不同株系侵染寄主時(shí)產(chǎn)生表現(xiàn)不同病癥的原因。

雖然 P1蛋白在氨基酸序列上存在高度的變異性(表3),但還是存在多個(gè)保守的 Motif(圖 4A),且行使P1蛋白功能密切相關(guān)的3個(gè)活性位點(diǎn)所在的氨基酸殘基均保持不變(圖 4A),從而保證該蛋白酶發(fā)揮正常的功能。比較N Clade、N×O Clade和O Clade 3種類型的P1蛋白活性位點(diǎn)空間位置(圖4B),顯示3個(gè)活性位點(diǎn)在空間位置相距較遠(yuǎn),可能影響P1蛋白酶的活性強(qiáng)弱。蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能在很大程度上取決于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),三級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)的最終目的[34]。弄清PVY P1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征,對(duì)于了解P1蛋白結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系具有重要的意義。

本文通過擴(kuò)增、克隆12個(gè)PVY福建分離物P1基因的cDNA全長序列,并通過系列分析表明PVYP1基因的變異源主要來自堿基突變,但部分分離物也存在明顯的基因重組現(xiàn)象。同時(shí),重組株系已成為福建馬鈴薯主栽區(qū)的主流。雖然P1基因高度變異,但行使 P1 proteinase 活性位點(diǎn)所在的 3個(gè)氨基酸(H192、D201和 V235)卻高度保守,從而保證該蛋白酶發(fā)揮正常的功能。

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