李嬌, 郭予琦, 崔偉玲, 許愛華, 田曾元

鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 鄭州 450001

玉米苗期SR蛋白基因家族的干旱脅迫應(yīng)答

李嬌, 郭予琦, 崔偉玲, 許愛華, 田曾元

鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 鄭州 450001

基因表達的選擇性剪接(Alternative splicing, AS)調(diào)控與植物對逆境脅迫應(yīng)答密切相關(guān), SR蛋白(Serine/ arginine-rich proteins)是其中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。文章對玉米B73參考基因組進行分析顯示: 多數(shù)SR蛋白家族基因成員啟動子區(qū)域含有3～8種與發(fā)育或脅迫相關(guān)的順式調(diào)控元件; 27個基因成員編碼堿性蛋白, 其中23個成員的編碼蛋白依照其N′端的首個RRM(RNA recognition motif)結(jié)構(gòu)域特征大體上可劃分為5個亞組。利用雙向分級聚類方法, 對三葉期干旱脅迫下玉米雜交種鄭單958及其親本鄭58和昌7-2的SR蛋白基因家族的分析顯示,該基因家族的表達模式具有明顯的組織表達特異性和基因型依賴性特征; 其中在干旱脅迫下地下組織以下調(diào)表達模式為主, 而地上組織中以上調(diào)表達模式為主。在重度干旱脅迫后的3個不同時段復(fù)水過程中, 地上和地下組織中SR蛋白基因家族的表達皆以下調(diào)表達模式為主。另外, 盡管不同基因成員的表達模式在干旱脅迫及其后的復(fù)水過程中存在明顯差異, 但普遍存在自身選擇性剪接現(xiàn)象。SR蛋白基因家族在玉米干旱脅迫的應(yīng)答規(guī)律, 為從AS-network視角解析玉米的抗逆分子機制提供了新思路。

玉米干旱脅迫; SR蛋白基因; 表達模式; 選擇性剪接

選擇性剪接(Alternative splicing, AS)又叫可變剪接, 指某真核生物基因轉(zhuǎn)錄出的 pre-mRNA通過不同的剪接方式和剪接位點的選擇調(diào)節(jié), 形成不同的成熟mRNA的過程。以不同的成熟mRNA為模板翻譯出不同的蛋白質(zhì)變體形式, 能夠豐富蛋白質(zhì)組的多樣性和基因表達調(diào)控的靈活性[1]。研究表明, 植物中選擇性剪接的調(diào)節(jié)與逆境脅迫的適應(yīng)機制密切相關(guān)[2,3]: 擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、大麥(Hordeumvulgare)和小麥(Triticumaestivum)等物種的抗逆基因在環(huán)境脅迫條件下會發(fā)生選擇性剪接; 細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因可以通過選擇性剪接方式的改變使植物適應(yīng)干旱、高鹽、澇漬和低溫等逆境脅迫。干旱是嚴重影響玉米(Zea mays)生長發(fā)育的主要逆境因素。玉米耐旱性作為一種數(shù)量性狀, 不僅涉及生理、遺傳、農(nóng)藝等眾多因素, 也涉及脅迫響應(yīng)的大量轉(zhuǎn)錄因子基因及其下游受控基因的選擇性剪接調(diào)節(jié)[4]。

選擇性剪接機制受多種順式調(diào)控元件和反式作用因子互作的調(diào)節(jié), 包括 SR蛋白(Serine/argininerich proteins)家族和 hnRNP 蛋白(heterogeneous nuclear RNP)家族在內(nèi)的多種剪接因子參與的拮抗作用。SR蛋白成員都具有一個富含絲氨酸/精氨酸(S/R)重復(fù)序列的RS結(jié)構(gòu)域(RS domain), 在RNA剪接體的組裝和選擇性剪接的調(diào)控過程中具有重要的作用。絕大多數(shù)SR蛋白是生存的必需因子, 通過其RS結(jié)構(gòu)域和特有的RRM(RNA recognition motif)結(jié)構(gòu)域, 實現(xiàn)與前體mRNA的特異性序列或其他剪接因子的相互作用, 協(xié)同完成剪接位點的正確選擇或促進剪接體的形成。SR蛋白往往作為正調(diào)控因子與外元剪接增強子(Exon splicing enhancer, ESE)結(jié)合,而 hnRNP則作為負調(diào)控因子與外元剪接沉默子(Exon splicing silencer, ESS)結(jié)合, 共同構(gòu)筑了真核生物基因表達的AS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(AS-network)[5]。研究表明, 擬南芥中19個SR蛋白基因家族成員的表達具有發(fā)育和組織特異性, 并受非生物脅迫和植物激素影響, 其中的15個成員自身也存在選擇性剪接現(xiàn)象[6]。盡管Richardson等[7]對27個真核生物(包括玉米)的 SR蛋白基因家族成員進行了分類和比較, 但目前對玉米 SR蛋白基因家族不同成員在干旱脅迫下的差異表達模式及其自身選擇性剪接與下游基因脅迫應(yīng)答尚缺乏系統(tǒng)分析。玉米B73自交系基因組測序工作的完成, 為利用生物信息學(xué)手段開展玉米抗逆分子機制研究提供了契機[8]。鄭單958是近20年來全國推廣面積最大的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和廣適的玉米單交種。本文在系統(tǒng)分析玉米B73的SR蛋白基因家族成員的系統(tǒng)進化和啟動子區(qū)域順式調(diào)控元件特征的基礎(chǔ)上, 以玉米雜交種鄭單958及其親本(鄭58和昌7-2)為實驗材料, 分析SR蛋白基因家族在干旱脅迫下玉米雜種與親本中的應(yīng)答模式及其自身選擇性剪接規(guī)律, 豐富 AS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)視角下的玉米干旱脅迫分子機理。

1 材料和方法

1.1 玉米SR蛋白基因家族的生物信息學(xué)分析

玉米SR蛋白基因家族成員序列: 通過2009年11月20日完成的玉米B73自交系參考基因組序列數(shù) 據(jù) 庫 (http://www.maizesequence.org/index.html)獲取。

玉米 SR蛋白基因成員的序列特征分析: 利用SWTSS-PROT數(shù)據(jù)庫中的ExPASy Compute pI/Mw tool(http://web.expasy.org/compute_pi/)[9～11]在線分析工具, 對 SR蛋白的分子量及等電點(pI)等理化性質(zhì)進行分析。利用 Sanger-Pfam HMM Search (http:// pfam.sanger.ac.uk/search)、Profile Scan (http: // prosite.expasy.org/scanprosite/)[12～15]以及 predict protein(http://www.predictprotein.org/)在線分析工具對 SR蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行預(yù)測。

玉米 SR蛋白基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建: 玉米 28個SR蛋白基因家族成員中, 有5個基因(GRMZM2G-019738、GRMZM2G010754、GRMZM2G097593、GRMZM2G139085和GRMZM2G383967)的編碼蛋白在N′-端沒有RRM。在23個編碼蛋白含有RRM的基因成員中, 有 16個成員的編碼蛋白含單個 RRM, 有 7個成員(GRMZM2G021223、GRMZM2G052166、GRMZM2G064612、GRMZM2G121269、GRMZM2G-170365、GRMZM2G331811和GRMZM2G436092)的編碼蛋白擁有2個 RRM, 選取其位于N′-端的第 1個RRM, 進行基于RRM保守結(jié)構(gòu)域的SR蛋白基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。利用MEGA4.1軟件, 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, Bootstrap 值設(shè)置為500。

玉米SR基因啟動子順式調(diào)控元件分析: 從B73參考基因組數(shù)據(jù)庫中提取所選的 SR蛋白基因啟動區(qū)域——轉(zhuǎn)錄起始位點(Transcription start site, TSS)上游 1 kb序列, 應(yīng)用 PLACE(http://www.dna.affrc. go.jp/PLACE/)[16,17]對發(fā)育、植物激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)的主要順式作用元件進行量化分析和雙向分級聚類分析。

1.2 玉米SR基因選擇性剪接分析

1.2.1 實驗材料與處理

以鄭單958及其親本鄭58和昌7-2為材料, 選飽滿無菌種子種植于沙盒中, 于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件: 30℃ 16 h光照/26℃ 8h 黑暗, 相對濕度50%。在三葉期開始進行10 d控水處理, 通過測定葉片相對含水量(Relative water content, RWC)確定干旱脅迫程度, 分為中度干旱組(Moderate drought stress, MS), 相對含水量(67±3)%和重度干旱組(Severe drought stress, SS), 相對含水量(411±7)%，并對重度干旱脅迫處理組的植株進行4、24和48 h復(fù)水處理。實驗設(shè)3個重復(fù), 同時設(shè)立對照組。對處理組和對照組的倒二葉進行生理指標測定, 葉片RWC參考Larbi和Mekliche[18]方法測定。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成

對上述對照組、處理組和復(fù)水組玉米植株隨機各取出 5株分別進行地上和地下混合取樣, 液氮研磨后用按 Total RNA Purification Kit(LC Sciences, Cat. TRK-1001)用戶手冊進行總RNA提取, 紫外分光光度計測量A260和A280比值用以檢驗RNA提取質(zhì)量, -80℃貯存?zhèn)溆谩０凑?EasyScript First-Strand cDNASynthesis Super Mix(TaKaRa, Cat.: AE301)說明書, 以總RNA為模板, 以O(shè)ligo(dT)18為引物, 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.2.3 引物設(shè)計

對玉米SR蛋白基因家族成員進行qRT-PCR, 采用各基因成員不同剪接體共同外顯子區(qū)域的保守片段設(shè)計特異引物, 以檢測不同成員的差異表達(附表1); 對發(fā)生選擇性剪接事件的SR蛋白基因的AS變體進行RT-PCR, 采用不同剪接體的特異片段設(shè)計引物(附表2)。

1.2.4 基因表達分析與數(shù)據(jù)處理及熒光定量PCR

利用Bio-Rad PCR system進行基因表達定量分析。PCR反應(yīng)體系(20 μL): 模板(第一鏈cDNA) 1 μL,引物(Forward primer/Reverse primer)各0.5 μL, 2× MixTransStart?Top Green qPCRSuperMix(TransGen Biotech, Cat. AQ131-02) 10 μL, Passive Reference Dye II(50×) 0.4 μL, ddH2O 7.6 μL。PCR擴增程序: 95℃預(yù)變性30 s; 95°C變性5 s, 60°C復(fù)性30 s, 40輪循環(huán)。以玉米β-actin作為內(nèi)參基因, 實驗設(shè)3個重復(fù)。對熒光定量實驗結(jié)果用BIO-RAD RT-PCR讀取工具Opticon Monitor 3進行讀取, 采用-ΔΔCt法進行計算。SR蛋白基因家族成員表達譜, 用MeV v4.8 (http://mev.tm4.org/)[19]軟件進行量化分析和雙向分級聚類作圖。對發(fā)生選擇性剪接事件的SR基因AS變體進行半定量分析, PCR擴增循環(huán)數(shù)參考對應(yīng)基因qRT-PCR的Ct值。對半定量實驗的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳, 統(tǒng)計擴增出的不同 AS變體期望條帶(分子量見附表2)和新條帶(代表新的AS變體), 分析SR蛋白基因自身的選擇性剪接事件。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米SR蛋白家族基因的分子生物學(xué)特征分析

玉米 B73基因組數(shù)據(jù)庫中明確功能注釋的 SR蛋白基因家族共有28個成員(附表3), 在10條染色體上均有分布: 其中在4號染色體上有SR2E、SR7B、SR7E、SR10和RSP41C共5個成員分布, 在5和9號染色體上分別有 4個成員分布(SR7A、SR12B、RSZp22、RSP41D和SR2D、SR7F、SRP32、RSP41B),在10號染色體上有SRP1D、SR12A和 RSP41A共3個成員分布, 其余染色體上分別都有 2個成員分布(1號染色體的SR2B和SR2C, 2號染色體的SR2A和SC35, 3號染色體的SR1和SR30, 6號染色體的SR7D和SRP31, 7號染色體的SR4和SR7C)。該家族基因編碼的蛋白質(zhì)分子量最大(77.6 kDa)、氨基酸最長(712aa)的為 GRMZM2G474658_P01(SR6), 而編碼的蛋白質(zhì)分子量最小(6.5 kDa)、氨基酸序列長度最短(60aa)的為GRMZM2G383967_P01(SRP1D)。其中有27個基因成員的編碼蛋白為堿性(pH8.93～12.33),只有 GRMZM2G383967_P01(SRP1D)蛋白呈酸性(pH4.37)。對SRP1D的結(jié)構(gòu)分析表明其為SR1變體蛋白4, 但其基因序列并不具備5′-UTR區(qū)域和完整的ORF框, 也沒有RRM結(jié)構(gòu)域, 可能是沒有功能活性的假基因。

2.2 玉米SR蛋白基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

由28個成員組成的SR蛋白基因家族中, 對編碼蛋白中含有 RRM的 23個基因成員進行的基于RRM保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖1)表明,玉米SR蛋白家族的23個成員劃分為5個亞組。第I亞組包括5個成員: 4個SR7成員(SR7A/B/E/F)和RSZP22。第II亞組包括4個成員: 3個SRP41成員(SRP41A/B/C)和RS2A。第III亞組包括5個成員: SR6、SR7D、SR30、SRP31和SRP32。第IV亞組包括4個成員: SR2D、SR4、SR41D和SR45。第V亞組包括5個成員: 3個SR2成員(SR2B/C/E)、SR10和SR35。

圖1 基于RRM(RNA recognition motif)結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的玉米SR家族系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 玉米SR家族基因啟動子順式調(diào)控元件分析

對玉米B73參考基因組數(shù)據(jù)庫中SR蛋白基因的TSS上游1 kb序列進行分析(圖2)表明: 除核心啟動子元件(CAAT-Box, TATA-Box)外, 28個SR蛋白基因的啟動子區(qū)域中含有3～8種與發(fā)育、植物激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式調(diào)控元件; 90%以上的SR蛋白基因家族成員都含有MYB、MYC、GATA-BOX和WBOX調(diào)控元件, 57%(16/28)的成員含有ABRE調(diào)控元件, 36%(10/28)的成員含有LTR調(diào)控元件, 29% (8/28)的成員含有 T/G-BOX調(diào)控元件, 14%(4/28)的成員含有ARF或ERE調(diào)控元件, 7%(2/28)的成員含有 DRE調(diào)控元件。另外, 同一注釋名稱下的基因,如SR7有6個成員(SR7A/B/C/D/E/F), SR2有5個成員(SR2A/B/C/D/E),分別聚類于不同亞群中; 而不同的SR蛋白基因成員又能夠同時聚類于同一亞群。根據(jù)其原因可以推測: 即使相同注釋成員下的 SR蛋白基因不同成員, 也可能由于啟動子區(qū)域中順式調(diào)控元件的種類和數(shù)目的不同而具有差異的表達模式; 而不同的 SR蛋白基因也可能由于啟動子區(qū)域中順式調(diào)控元件的種類和數(shù)目的相似性而具有相似或相近的表達模式。

2.4 玉米SR蛋白家族基因與干旱脅迫應(yīng)答

植物葉片相對含水量(RWC)是植物組織水分狀況的重要指標, 對抗旱育種的選擇具有特殊的意義。本研究對鄭單958及其親本鄭58和昌7-2在三葉期中度和重度干旱脅迫處理后進行RWC測定(表1)。在中度干旱脅迫下, 葉片RWC及其與對照組的變化量在鄭單958及其親本鄭58和昌7-2間沒有顯著差異。而在重度干旱脅迫下, 葉片RWC及其與對照組的變化量在鄭單958及其親本鄭58和昌7-2間存在顯著差異, 其中鄭單958在水分脅迫下RWC變化較小, 表現(xiàn)對干旱脅迫較強的耐受性; 而昌7-2在干旱脅迫下水分變化量最大, 表現(xiàn)較強的水分脅迫敏感性。

圖2 玉米SR蛋白基因啟動子區(qū)域順式調(diào)控元件分析方格中紅色深淺表示啟動子區(qū)域順式調(diào)控元件拷貝數(shù)多少。

表1 鄭單958及其親本干旱脅迫下葉片RWC變化比較

2.4.1 干旱脅迫下SR蛋白基因差異表達

根據(jù)前期玉米自交系旱21和掖478的SR蛋白基因家族干旱脅迫下基因數(shù)字化表達譜結(jié)果(未發(fā)表結(jié)果), 選取其中 13個顯著差異表達的基因成員,對鄭單 958及其親本在干旱脅迫下基因差異表達進行 qRT-PCR檢測(圖 3)?；虿町惐磉_譜經(jīng)雙向分級聚類分析表明: 無論地上組織或地下組織, 同一基因型材料的中度干旱組和重度干旱組多聚類于同一亞群中(如ZD958-MS-S和ZD958-SS-S、Z58-MS-R和Z58-SS-S、C7-2-MS-R和C7-2-SS-R分別聚類于最小亞群中; C7-2-MS-S和C7-2-SS-S、ZD958-MS-R和 ZD958-SS-R分別聚類于較小亞群中); 對同一組織而言, 同一基因型材料隨干旱脅迫程度加劇, SR蛋白基因家族的整體表達模式仍具有調(diào)控的連續(xù)性和較強的基因型依賴性(如 ZD958-MS-S和ZD958-SS-S、C7-2-MS-R和C7-2-SS-R分別聚類于最小亞群中; C7-2-MS-S和C7-2-SS-S、ZD958-MS-R和ZD958-SS-R分別聚類于較小亞群中)。

對地下組織而言, 顯著性上調(diào)(Log2處理/對照＞1)和顯著性下調(diào)(Log2處理/對照＜-1)的樣品分別為 21和 44,表明 SR蛋白基因家族在干旱脅迫下整體表達模式以下調(diào)為主; 對地上組織而言, 顯著性上調(diào)和顯著性下調(diào)的樣品分別為27和17, 表明SR蛋白基因家族在干旱脅迫下整體表達模式以上調(diào)為主。除鄭58中度干旱的根(Z58-MS-R)和重度干旱地上組織(Z58-SS-S)外, 鄭單958和昌7-2的地上組織和地下組織有規(guī)律地聚類于兩個不同亞群中, 表明 SR蛋白基因家族整體表達模式在不同遺傳材料中具有較一致的組織特異性。

對同一基因型材料的不同組織而言, 中度干旱處理下 SR蛋白家族基因顯著性反向調(diào)節(jié)的有23.1%(9/39), 重度干旱處理下 SR蛋白家族基因顯著性反向調(diào)節(jié)的有35.9%(14/39), 表明SR蛋白基因家族組織特異性調(diào)節(jié)的差異隨干旱脅迫程度加劇而更明顯。另外, 在干旱脅迫下SR基因家族不同成員的表達模式有明顯差異: SR2B和SC35在50%以上的脅迫樣品中顯著下調(diào)表達, 而 SR7D則在 50%以上的脅迫樣品中顯著上調(diào)表達。

2.4.2 復(fù)水處理后SR蛋白基因差異表達

由于只在重度干旱脅迫下鄭單 958及其親本鄭58和昌7-2之間的葉片RWC才表現(xiàn)出顯著差異, 因此對重度干旱脅迫處理組的植株進行了 3個不同時間段(4 h、24 h和48 h)的復(fù)水處理。對選取的13個玉米 SR蛋白基因家族成員在不同時間段復(fù)水處理的差異表達譜分析(圖4)表明: 與干旱組處理情形規(guī)律相似, 除鄭58復(fù)水4 h地上組織(Z58-4h-S)外, 鄭單958和昌7-2的地上組織和地下組織的SR蛋白基因表達模式都有規(guī)律的聚類于各自不同亞群中; 無論地上組織或地下組織, 同一基因型材料的不同復(fù)水時段 SR蛋白基因表達模式基本聚于同一亞群中;表明對同一組織而言, 同一基因型材料隨復(fù)水時段的延長, SR蛋白基因家族的整體表達模式具有調(diào)控的連續(xù)性。

對地下組織而言, 顯著性上調(diào)和顯著性下調(diào)的樣品分別為29和56, 表明SR蛋白基因家族在干旱脅迫后的復(fù)水處理過程中整體表達模式以下調(diào)為主;對地上組織而言, 顯著性上調(diào)和顯著性下調(diào)的樣品分別為29和50, 表明SR蛋白基因家族在干旱脅迫后的復(fù)水處理過程中整體表達模式也以下調(diào)為主。以上結(jié)果表明, 在干旱脅迫后的復(fù)水處理過程中SR蛋白基因家族整體表達模式以下調(diào)為主。

復(fù)水處理過程中 SR蛋白家族不同成員的表達模式表現(xiàn)出不同趨勢: 其中成員 SR45、SR12A、SR12B、SC35和SR7A在50%以上的復(fù)水樣品中顯著下調(diào)表達; 而成員SR7B和RSP41A則在50%以上的復(fù)水樣品中顯著上調(diào)表達。

2.4.3 干旱脅迫下SR蛋白自身的選擇性剪接

SR基因是一類對選擇性剪接起重要調(diào)控作用的剪接因子[20,21]。Richardson等[7]研究表明, 在其統(tǒng)計的22個玉米SR基因中有21個能夠發(fā)生自身選擇性剪接, 而且主要以3′選擇性剪接方式為主。

圖3 玉米SR基因干旱脅迫差異表達分析ZD958、Z58和C7-2分別表示鄭單958及其親本鄭58和昌7-2; MS和SS分別表示中度和重度干旱脅迫處理組; S和R分別表示中度地上組織(Shoot)和地下組織(Root)。圖中所示處理組/對照組的相對表達量(-ΔΔCt)變化趨勢(上/下調(diào))用不同顏色(紅/綠)的深淺程度表示, 其中綠色越深代表下調(diào)表達越明顯, 紅色越深代表上調(diào)表達越顯著。下圖同。

圖4 玉米SR基因復(fù)水處理組差異表達分析ZD958、Z58和C7-2分別表示鄭單958及其親本鄭58和昌7-2; 4 h、24 h和48 h分別表示復(fù)水4 h、24 h和48 h; S和R分別表示地上組織(Shoot)和地下組織(Root)。

本研究對選取SR蛋白家族的13個成員, 根據(jù)各基因不同 AS變體特異性片段設(shè)計引物, 進行半定量PCR擴增, 對擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳預(yù)期條帶和新AS變體產(chǎn)生的新條帶進行統(tǒng)計(附表4)。結(jié)果表明: (1)53.8%(7/13)的SR成員AS變體數(shù)目在對照組多于干旱脅迫組, 而 46.2%(6/13)的 SR成員AS變體數(shù)目在對照組少于干旱脅迫組; (2)同一 SR基因的 AS變體數(shù)目分布: 鄭 58＞昌 7-2＞鄭單 958; (3)有12個SR基因成員中檢測到有新的AS變體形式。圖 5 A顯示 GRMZM2G099317(SR7D)基因中在C7-2-DS-R樣品中檢測到有新的AS變體(Novel1) 形式。

圖5 GRMZM2G099317(SR7D)和?-actin基因半定量PCR擴增的凝膠電泳圖ZD958、Z58和C7-2分別表示鄭單958及其親本鄭58和昌7-2; CK和DS分別表示對照組和干旱脅迫處理組; S和R分別表示地上組織(Shoot)和地下組織(Root)。A 圖中箭頭所指 T02/T03/T04/ T05為玉米 B73參考基因組序列數(shù)據(jù)庫(http://www.maizesequence.org/index.html)中GRMZM2G099317注釋的AS變體編號(T02/03/04/05), Novel1為新的AS變體條帶。

3 討 論

SR蛋白基因家族作為一類重要的選擇性剪接因子, 通過對轉(zhuǎn)錄本ESE的識別與結(jié)合參與剪接體的組裝, 進而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接。對玉米B73參考基因組測序結(jié)果的分析表明, 玉米SR蛋白基因家族的28個成員在玉米10條染色體上均有分布, 啟動子區(qū)域中含有 3～8種與發(fā)育、植物激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式調(diào)控元件; 27個基因編碼堿性蛋白質(zhì), 另外1個基因可能為假基因。其中的23個基因編碼蛋白依其N′-端的首個RRM結(jié)構(gòu)域大體上劃分為 5個亞組。鄭單 958及其親本鄭 58和昌7-2在三葉期進行的干旱脅迫及其后的復(fù)水過程中, SR蛋白基因家族整體表達模式不但具有組織表達特異性和基因型依賴性特點, 而且不同成員的表達模式也存在明顯差異, 并普遍存在自身選擇性剪接現(xiàn)象。

3.1 SR蛋白基因參與脅迫響應(yīng)的分子基礎(chǔ)

玉米的SR蛋白基因啟動子含有多種與發(fā)育、植物激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)順式調(diào)控元件: 90%以上啟動子含有MYB、MYC、GATA -BOX和WBOX應(yīng)答元件, 部分成員還含有ABRE、LTR、T/GBOX、ARF和DRE應(yīng)答元件。其中LTR元件能夠?qū)Φ蜏禺a(chǎn)生應(yīng)答; GATA-BOX對光調(diào)節(jié)產(chǎn)生應(yīng)答; WBOX能夠通過與WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合, 對植物的抗性和發(fā)育產(chǎn)生響應(yīng)和調(diào)節(jié)。植物基因啟動子中的ABRE、DRE和MYC能夠直接或間接影響ABA兩種相互交叉途徑形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。玉米不同SR蛋白基因家族成員啟動子區(qū)域存在多種脅迫響應(yīng)元件, 表明 SR蛋白基因的表達有其參與脅迫響應(yīng)基因選擇性剪接調(diào)控的分子基礎(chǔ); 而順式調(diào)控元件的種類、拷貝數(shù)和組合方式的差異, 則預(yù)示 SR蛋白基因表達模式的多樣性和應(yīng)對不同脅迫的靈活性。

3.2 SR蛋白家族基因表達與脅迫響應(yīng)

在鄭單958及其親本鄭58和昌7-2苗期干旱脅迫及其后復(fù)水過程中, SR蛋白基因家族雖然整體上表現(xiàn)出組織表達特異性和基因型依賴性特點, 但不同成員的表達模式又呈明顯差異: SC35在50%以上的脅迫處理樣品和復(fù)水處理樣品中顯著下調(diào)表達,而SR7B和RSP41A則在50%以上的復(fù)水處理樣品中顯著上調(diào)表達。擬南芥中多個SR蛋白家族的基因成員在高溫、高鹽和強光條件下表達量顯著改變[22,23]。SCL33能夠影響鹽分和低溫脅迫下 ABA響應(yīng)基因的表達[6,24]。SR45是SC35like類SR蛋白, 在剪接過程中常與U1-70K互作[25], 影響5′-端和3′-端剪接位點的選擇[26]。苗期SR45通過下調(diào)ABA信號通路相關(guān)基因的表達來調(diào)節(jié)ABA和葡萄糖信號途徑[27]。在玉米中ZmSRp32的過量表達能夠?qū)е聀re-mRNA加工過程中 5'剪接位點的增強[28]。由此看來, 篩選和鑒定玉米干旱脅迫響應(yīng)的 SR蛋白基因成員, 并分析其表達模式對轉(zhuǎn)錄組所涉基因的具體 AS調(diào)節(jié)方式的影響, 是解析 AS調(diào)控機制在玉米抗逆過程的關(guān)鍵工作之一。

3.3 SR蛋白基因的AS調(diào)節(jié)與脅迫響應(yīng)

植物SR蛋白家族基因自身的AS調(diào)節(jié)具有普遍性。對玉米SR蛋白家族28個成員自身的AS統(tǒng)計表明, 大多數(shù)SR蛋白家族基因成員存在自身AS方式, 且以3'選擇性剪接方式為主(結(jié)果未發(fā)表); 本文選取的13個SR蛋白家族基因成員中有12個能夠檢測到有新的AS變體形式。SR蛋白基因的自身選擇性剪接能夠調(diào)節(jié)下游基因的選擇性剪接事件。SR45基因在擬南芥中有多種剪接變體, 并在多種逆境脅迫下上調(diào)表達, 揭示其為干旱脅迫相關(guān)基因[21,29];其中兩個剪接變體分別控制花和根的形態(tài)發(fā)育[25]。高光脅迫下, atSR45a基因能夠通過自身選擇性剪接機制精細調(diào)節(jié)2種變體(atSR45a-1和atSR45a-2)的比率來影響剪接體的組裝效率[22,30], 進而顯著改變下游217個基因的選擇性剪接模式[20]。這些下游基因的表達主要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期、DNA加工、蛋白質(zhì)命運和轉(zhuǎn)錄活動等。上述研究提示, 玉米脅迫響應(yīng)的SR蛋白基因成員有可能通過自身AS變體的精細調(diào)節(jié), 影響轉(zhuǎn)錄組組分及其相對表達豐度,進而多維地調(diào)整植物體對逆境脅迫的適應(yīng)性。

本文系統(tǒng)分析了玉米 SR蛋白基因家族在干旱脅迫下的基因表達規(guī)律和自身選擇性剪接現(xiàn)象。與一般的編碼蛋白基因表達情形類似, 其表達模式具有組織特異性和基因型依賴性特點, 預(yù)示著 AS介導(dǎo)的基因表達調(diào)控機制能夠影響干旱脅迫下植物體轉(zhuǎn)錄組可塑性的復(fù)雜程度。另外, SR蛋白基因家族的表達主要以劑量效應(yīng)和 RS結(jié)構(gòu)域中絲氨酸殘基的磷酸化狀態(tài)與程度, 作為正調(diào)控因子參與基因表達的選擇性剪接。在其活性調(diào)節(jié)過程中, RS結(jié)構(gòu)域的磷酸化/去磷酸化是參與選擇性剪接的主要條件, 參與SR蛋白磷酸化的激酶主要有SRPK1和Clk/Sty[31]。因此, 篩選通用型的干旱脅迫相關(guān)的 SR基因成員并鑒定其主要的AS變體形式, 厘清SR蛋白基因表達—下游基因 AS調(diào)節(jié)—玉米抗旱性三者的關(guān)聯(lián)程度, 研究其 RS結(jié)構(gòu)域中絲氨酸殘基的磷酸化狀態(tài)、克隆涉及的激酶基因并揭示其與玉米干旱脅迫響應(yīng)的內(nèi)在規(guī)律, 將深化從AS-network視角探索玉米的抗逆分子機制研究。

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(責(zé)任編委: 郝東云)

Response of maize serine/arginine-rich protein gene family in seedlings to drought stress

Jiao Li, Yuqi Guo, Weiling Cui, Aihua Xu, Zengyuan Tian

College of Life Science, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China

Alternative splicing (AS) in eukaryotic organisms is closely related to the gene regulation in plant abiotic stress responses, in which serine/arginine-rich proteins (SR proteins) act as key regulators. The genome sequence of maize inbred line B73 was analyzed, showing that the promoter regions of SR genes possess about three to eight kinds of cis-acting regulatory elements. Twenty-seven SR genes encode alkaline proteins, and 23 of which are divided into five subgroups in terms of the first RNA recognition motif (RRM) at the amino terminal. The expression of SR genes showed tis-sue-specific and genotype-dependent features under drought stress in the hybrid Zhengdan-958 and its parents, Zheng-58 and Chang-7-2 via bidirectional hierarchical clustering. SR genes were down-regulated in roots while they were up-regulated in shoots under drought stress. However, SR genes were down-regulated in both roots and shoots in three different rehydration stages after severe drought stress. Additionally, a widespread alternative splicing exists in all SR genes although SR genes showed differential expression tendency under drought stress and/or during rehydration stages. Results above will deepen our understanding of the molecular mechanisms of plant response to abiotic stress from the perspective of AS-network.

maize under drought stress; SR genes; expressional pattern; alternative splicing

2013-12-12;

2014-03-07

基金農(nóng)業(yè)部948項目(編號：2012-Z38)資助

李嬌, 碩士研究生, 專業(yè)方向：植物分子生物學(xué)。E-mail: li_jiao_2006@126.com

郭予琦, 博士, 副教授, 研究方向：植物抗逆分子機理。E-mail: guoyuqi@zzu.edu.cn

李嬌和郭予琦同為第一作者。

田曾元, 博士, 副教授, 研究方向：玉米逆境脅迫分子機制。E-mail: tianzengyuan@zzu.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0697

時間: 2014-6-16 17:06:11

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140616.1706.001.html