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        甘草藥渣中還原糖的提取工藝研究

        2014-05-23 07:11:06郭朝暉李耀曾丁永輝趙建邦李士博
        衛(wèi)生職業(yè)教育 2014年10期
        關(guān)鍵詞:光吸收藥渣底物

        孫 鶯 ,郭朝暉 ,李耀曾 ,丁永輝 ,趙建邦 ,李士博

        (1.甘肅省食品藥品檢驗所,甘肅 蘭州 730000;2.甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局,甘肅 蘭州 730000;3.甘肅省中藥品質(zhì)與安全評價工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州 730000)

        甘草是最常用又很有用的中藥材,在中醫(yī)處方中占有重要的地位。近年來,甘草藥材由于遭到過度采挖,資源急劇減少,因此合理利用和保護甘草資源十分必要。甘草的主要有效成分是甘草酸、黃酮和多糖類化合物,但目前甘草提取甘草酸后,剩余的藥渣通常作為廢棄物遺棄,造成極大的資源浪費[1-4]。依靠纖維素酶將纖維素水解,其中酶水解原理是利用葡聚糖內(nèi)切酶和葡聚糖外切酶的協(xié)同作用將纖維素降解成纖維寡糖和纖維二糖,然后在β-葡萄糖苷酶的作用下將纖維寡糖和纖維二糖最終降解成為葡萄糖[5-8]。本文以甘草藥渣為主要原料,研究纖維素酶酶解藥渣制備還原糖的工藝條件,采用3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖,從而為解決甘草藥渣綜合利用的問題提供了新的途徑,實現(xiàn)了可再生資源的充分利用,同時也解決了環(huán)境污染的難題[9]。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        甘草藥渣(采用滲濾法提取甘草酸后的烏拉爾甘草藥渣,粉碎后過三號篩的細粉);纖維素酶(銀川開發(fā)區(qū)和氏璧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn));無水醋酸鈉;冰醋酸;3,5-二硝基水楊酸(DNS);無水葡萄糖;無水酒石酸鉀鈉;氫氧化鈉;重蒸苯酚;無水亞硫酸鈉。

        SHA-C恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司生產(chǎn)),WG2003臺式干燥箱(重慶國華電器有限公司生產(chǎn)),Lambda35紫外可見分光光度計(美國PE公司生產(chǎn)),AL204分析天平(METTLER公司生產(chǎn)),PHS-3C精密pH計(上海精科儀器有限公司生產(chǎn))。

        1.2 實驗方法

        稱取一定量的甘草藥渣于錐形瓶中,在給定的底物量、纖維素酶用量、溫度、時間及適當pH條件下,放入恒溫振蕩器中進行酶解反應。反應結(jié)束后,采用3,5-二硝基水楊酸法[10],在550nm波長處測定光吸收值,光吸收值與還原糖含量成正比,根據(jù)葡萄糖標準曲線(以葡萄糖為標準物)可以計算其中酶解液還原糖含量。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 標準曲線的繪制

        精密稱取100mg無水葡萄糖(預先在80℃烘箱中干燥至恒重),用蒸餾水定容于100mL的容量瓶中,搖勻。用移液管分別準確吸取上述葡萄糖溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL于15mL具塞刻度試管中,加蒸餾水至2.0mL,再分別加入2.0mLDNS顯色液,混勻后于沸水浴中煮沸10分鐘(另外制作一管作為對照,取2.0mL蒸餾水,2.0mLDNS顯色液,同樣煮沸10分鐘),冷卻后稀釋至15mL,在550nm波長處測定光吸收值。葡萄糖含量與光吸收值的關(guān)系見表1。以O(shè)D值為縱坐標,對應標準葡萄糖溶液含糖的mg數(shù)為橫坐標繪制標準曲線,見圖1。

        表1 葡萄糖含量與光吸收值的關(guān)系

        圖1 葡萄糖標準曲線

        計算得標準曲線方程為:y=0.7541x-0.0205,R=0.998,由圖1可以看出:葡萄糖含量與光吸收值兩者呈線性關(guān)系。

        2.2 不同酶濃度對酶解反應的影響

        溫度為50℃,時間為12小時,底物量2g,pH=4.8緩沖液100mL,不同酶濃度對酶解反應的影響見表2。由表中數(shù)據(jù)可以看出:底物量一定的情況下,隨著纖維素酶用量的增加,甘草藥渣的水解率迅速升高,當酶量增加到50mg時,再增加纖維素酶用量,光吸收值變化不明顯,即還原糖含量變化不明顯,所以確定50mg為最佳酶量。這說明當纖維素酶用量達到飽和時,增加酶用量對甘草藥渣酶解作用的影響很小。

        表2 不同酶濃度對酶解反應的影響

        2.3 不同底物量對酶解反應的影響

        溫度為50℃,時間為12小時,纖維素酶50mg,pH=4.8緩沖液100mL,不同底物量對酶解反應的影響見表3。由表中數(shù)據(jù)可以看出:隨著底物量的增加,A550值增大,底物量從5g增加至6g后,A550值基本保持不變,說明底物量達到5g時,還原糖含量變化已趨于平緩,增加底物量對反應影響不大,最佳底物量為5g,由此初步確定酶料比(酶量與底物量之比)為1:100。

        表3 不同底物量對酶解反應的影響

        2.4 不同反應時間對酶解反應的影響

        溫度為50℃,纖維素酶50m g,底物量5g,pH=4.8緩沖液100ml,不同反應時間對酶解反應的影響見表4。由表中數(shù)據(jù)可以看出,反應時間太長或太短都不能達到理想的效果,因此選取時間短且A550值大的反應時間,即最佳反應時間為8小時。

        表4 不同反應時間對酶解反應的影響

        2.5 不同初始pH對酶解反應的影響

        溫度為50℃,時間為8小時,底物量5g,纖維素酶50m g,緩沖液100mL,不同初始pH對酶解反應的影響見表5。由表中數(shù)據(jù)可以看出,在初始pH低于4.8時,隨初始pH的升高,即表中A550的值增大,說明還原糖含量增加;在初始pH高于4.8時,隨初始pH的升高,表中A550的值減小,說明還原糖含量減少,即最佳酶解pH為4.8。

        表5 不同初始pH對酶解反應的影響

        2.6不同溫度對酶解反應的影響

        時間為8小時,底物量5g,纖維素酶50mg,pH=4.8緩沖液100mL,不同溫度對酶解反應的影響見表6。由表中數(shù)據(jù)可以看出,當溫度為50℃時,表中A550的值最大,表示還原糖含量最高,溫度過高會導致纖維素酶由于受熱失活,而使酶解率降低,因此最佳酶解溫度為50℃。2.7不同料液比(底物量與緩沖液量之比)對酶解反應的影響

        表6 不同溫度對酶解反應的影響

        溫度為50℃,時間為8小時,底物量5g,纖維素酶50m g,pH=4.8,不同料液比(底物量一定,加入不同量的緩沖液之比)對酶解反應的影響見表7。在實驗過程中發(fā)現(xiàn),當料液比大于1:20時,由于藥渣濃度過高,過濾很難進行;當料液比小于1:20時,表中A550的值逐漸減小,說明還原糖含量逐漸降低,所以最佳料液比為1:20。

        表7 不同料液比對酶解反應的影響

        3 結(jié)語

        纖維素酶酶解甘草藥渣制備還原糖的最佳條件是溫度50℃,pH=4.8,反應時間8小時,酶料比1:100,料液比1:20。此酶解液可用于進一步培養(yǎng)酵母菌或發(fā)酵L-乳酸等各種有機酸,固體殘渣可用于生產(chǎn)蛋白飼料等。

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