孫 鶯 ，郭朝暉 ，李耀曾 ，丁永輝 ，趙建邦 ，李士博

（1.甘肅省食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥品質(zhì)與安全評價工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730000）

甘草是最常用又很有用的中藥材，在中醫(yī)處方中占有重要的地位。近年來，甘草藥材由于遭到過度采挖，資源急劇減少，因此合理利用和保護甘草資源十分必要。甘草的主要有效成分是甘草酸、黃酮和多糖類化合物，但目前甘草提取甘草酸后，剩余的藥渣通常作為廢棄物遺棄，造成極大的資源浪費[1-4]。依靠纖維素酶將纖維素水解，其中酶水解原理是利用葡聚糖內(nèi)切酶和葡聚糖外切酶的協(xié)同作用將纖維素降解成纖維寡糖和纖維二糖，然后在β-葡萄糖苷酶的作用下將纖維寡糖和纖維二糖最終降解成為葡萄糖[5-8]。本文以甘草藥渣為主要原料，研究纖維素酶酶解藥渣制備還原糖的工藝條件，采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖，從而為解決甘草藥渣綜合利用的問題提供了新的途徑，實現(xiàn)了可再生資源的充分利用，同時也解決了環(huán)境污染的難題[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草藥渣（采用滲濾法提取甘草酸后的烏拉爾甘草藥渣，粉碎后過三號篩的細粉）；纖維素酶（銀川開發(fā)區(qū)和氏璧生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；無水醋酸鈉；冰醋酸；3，5-二硝基水楊酸（DNS）；無水葡萄糖；無水酒石酸鉀鈉；氫氧化鈉；重蒸苯酚；無水亞硫酸鈉。

SHA-C恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司生產(chǎn)），WG2003臺式干燥箱（重慶國華電器有限公司生產(chǎn)），Lambda35紫外可見分光光度計（美國PE公司生產(chǎn)），AL204分析天平（METTLER公司生產(chǎn)），PHS-3C精密pH計（上海精科儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.2 實驗方法

稱取一定量的甘草藥渣于錐形瓶中，在給定的底物量、纖維素酶用量、溫度、時間及適當pH條件下，放入恒溫振蕩器中進行酶解反應。反應結(jié)束后，采用3，5-二硝基水楊酸法[10]，在550nm波長處測定光吸收值，光吸收值與還原糖含量成正比，根據(jù)葡萄糖標準曲線（以葡萄糖為標準物）可以計算其中酶解液還原糖含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的繪制

精密稱取100mg無水葡萄糖（預先在80℃烘箱中干燥至恒重），用蒸餾水定容于100mL的容量瓶中，搖勻。用移液管分別準確吸取上述葡萄糖溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL于15mL具塞刻度試管中，加蒸餾水至2.0mL，再分別加入2.0mLDNS顯色液，混勻后于沸水浴中煮沸10分鐘（另外制作一管作為對照，取2.0mL蒸餾水，2.0mLDNS顯色液，同樣煮沸10分鐘），冷卻后稀釋至15mL，在550nm波長處測定光吸收值。葡萄糖含量與光吸收值的關(guān)系見表1。以O(shè)D值為縱坐標，對應標準葡萄糖溶液含糖的mg數(shù)為橫坐標繪制標準曲線，見圖1。

表1 葡萄糖含量與光吸收值的關(guān)系

圖1 葡萄糖標準曲線

計算得標準曲線方程為：y=0.7541x-0.0205，R=0.998，由圖1可以看出：葡萄糖含量與光吸收值兩者呈線性關(guān)系。

2.2 不同酶濃度對酶解反應的影響

溫度為50℃，時間為12小時，底物量2g，pH=4.8緩沖液100mL，不同酶濃度對酶解反應的影響見表2。由表中數(shù)據(jù)可以看出：底物量一定的情況下，隨著纖維素酶用量的增加，甘草藥渣的水解率迅速升高，當酶量增加到50mg時，再增加纖維素酶用量，光吸收值變化不明顯，即還原糖含量變化不明顯，所以確定50mg為最佳酶量。這說明當纖維素酶用量達到飽和時，增加酶用量對甘草藥渣酶解作用的影響很小。

表2 不同酶濃度對酶解反應的影響

2.3 不同底物量對酶解反應的影響

溫度為50℃，時間為12小時，纖維素酶50mg，pH=4.8緩沖液100mL，不同底物量對酶解反應的影響見表3。由表中數(shù)據(jù)可以看出：隨著底物量的增加，A550值增大，底物量從5g增加至6g后，A550值基本保持不變，說明底物量達到5g時，還原糖含量變化已趨于平緩，增加底物量對反應影響不大，最佳底物量為5g，由此初步確定酶料比（酶量與底物量之比）為1:100。

表3 不同底物量對酶解反應的影響

2.4 不同反應時間對酶解反應的影響

溫度為50℃，纖維素酶50m g，底物量5g，pH=4.8緩沖液100ml，不同反應時間對酶解反應的影響見表4。由表中數(shù)據(jù)可以看出，反應時間太長或太短都不能達到理想的效果，因此選取時間短且A550值大的反應時間，即最佳反應時間為8小時。

表4 不同反應時間對酶解反應的影響

2.5 不同初始pH對酶解反應的影響

溫度為50℃，時間為8小時，底物量5g，纖維素酶50m g，緩沖液100mL，不同初始pH對酶解反應的影響見表5。由表中數(shù)據(jù)可以看出，在初始pH低于4.8時，隨初始pH的升高，即表中A550的值增大，說明還原糖含量增加；在初始pH高于4.8時，隨初始pH的升高，表中A550的值減小，說明還原糖含量減少，即最佳酶解pH為4.8。

表5 不同初始pH對酶解反應的影響

2.6不同溫度對酶解反應的影響

時間為8小時，底物量5g，纖維素酶50mg，pH=4.8緩沖液100mL，不同溫度對酶解反應的影響見表6。由表中數(shù)據(jù)可以看出，當溫度為50℃時，表中A550的值最大，表示還原糖含量最高，溫度過高會導致纖維素酶由于受熱失活，而使酶解率降低，因此最佳酶解溫度為50℃。2.7不同料液比（底物量與緩沖液量之比）對酶解反應的影響

表6 不同溫度對酶解反應的影響

溫度為50℃，時間為8小時，底物量5g，纖維素酶50m g，pH=4.8，不同料液比（底物量一定，加入不同量的緩沖液之比）對酶解反應的影響見表7。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，當料液比大于1:20時，由于藥渣濃度過高，過濾很難進行；當料液比小于1:20時，表中A550的值逐漸減小，說明還原糖含量逐漸降低，所以最佳料液比為1:20。

表7 不同料液比對酶解反應的影響

3 結(jié)語

纖維素酶酶解甘草藥渣制備還原糖的最佳條件是溫度50℃，pH=4.8，反應時間8小時，酶料比1:100，料液比1:20。此酶解液可用于進一步培養(yǎng)酵母菌或發(fā)酵L-乳酸等各種有機酸，固體殘渣可用于生產(chǎn)蛋白飼料等。

[1]邢國秀，李楠，王童，等．甘草中黃酮類化學成分的研究進展[J].中國中藥雜志，2003，28（7）：593-597.

[2]李紅，李炳奇，劉紅，等.甘草渣中黃酮和多糖的提取及含量測定[J].中國食品添加劑，2006（6）：193-196.

[3]王蕓蕓，劉利軍，王丹，等.甘草廢渣的綜合利用[J].飼料工業(yè)，2009，30（3）：44-45.

[4]徐忠，楊雪欣，汪群彗，等.大豆秸稈纖維素酶水解條件的研究[J].食品工業(yè)科技，2004，25（3）：58-59.

[5]Kim K H，Brown K M，Harris P V，et al.A proteomics strategy to discover beta-glucosidases from Aspergillus fumigatus with two dimensional page ingel activity assay and tandem mass spectrometry[J].J Proteome Res，2007，6（12）：4749-4757.

[6]周建，羅學剛，蘇林.纖維素酶法水解的研究現(xiàn)狀及展望[J].化工科技，2006，14（2）：51-56.

[7]Thomas M.Wood properities of cellulodytic enzyme systems[M].Birmingham：Biochemistry society Transaction，1985.

[8]顧方媛，陳朝銀，石家驥，等.纖維素酶的研究進展與發(fā)展趨勢[J].微生物學雜志，2008，28（1）：83-87.

[9]遲慶國.纖維素酶水解農(nóng)田纖維素廢棄物生產(chǎn)還原糖的研究[J].化學與生物工程，2009，26（6）：88-90.

[10]寧正祥.食品成分分析手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2001.