湯秋華 林 輝 張一帆 黃祥昌

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院，福建 泉州 362000）

動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定醒腦靜注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素含量

湯秋華 林 輝 張一帆 黃祥昌

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院，福建 泉州 362000）

目的建立醒腦靜注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定方法。方法采用《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄中細(xì)菌內(nèi)毒素的動(dòng)態(tài)濁度法。結(jié)果將醒腦靜注射液稀釋80倍，用細(xì)菌內(nèi)毒素定量法檢測(cè)無(wú)干擾因素影響，其平均回收率均在50%～200%。結(jié)論該法快捷、準(zhǔn)確、靈敏，可用于醒腦靜注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)。

醒腦靜注射液；細(xì)菌內(nèi)毒素；動(dòng)態(tài)濁度法鱟試驗(yàn)

醒腦靜注射液是由麝香、冰片、梔子、郁金四味中藥提取精制而成的中藥制劑，能夠透過(guò)血腦屏障，直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，能有效降低血腦屏障通透性，起到調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)，保護(hù)大腦、減輕腦水腫和改善微循環(huán)等作用，具有清熱瀉火，涼血解毒，開竅醒腦功效。臨床用于治療腦血管意外、乙型腦炎、肺性腦病、心絞痛等療效較好，且療效確切[1]。現(xiàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了熱原檢查項(xiàng)[2]，注射劑量為2 mL/kg。現(xiàn)有文獻(xiàn)僅有用凝膠法檢測(cè)醒腦靜注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的研究報(bào)道[3]，但未見采用動(dòng)態(tài)濁度法對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)，本文根據(jù)中國(guó)藥典2010版藥典中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究的指導(dǎo)原則要求，探討了動(dòng)態(tài)濁度法定量檢測(cè)醒腦靜注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的可行性，結(jié)果滿意。

1 材 料

BET-48G細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；ZH-2型自動(dòng)旋渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；定量鱟試劑（TAL，批號(hào)120813，檢測(cè)限0.01～10 EU/mL，規(guī)格0.5毫升/支，廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET，批號(hào)110801，規(guī)格10毫升/支，內(nèi)毒素含量＜0.005 Eu/mL，廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)150601-201175，規(guī)格150毫升/支，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；醒腦靜注射液（河南天地藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20130427、20130721、20130830，規(guī)格：10毫升/支）；所有玻璃器皿經(jīng)250 ℃至少2 h除去外源性熱原。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定[4]：L=K/M，K為規(guī)定的給藥途徑，即人每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑為5.0 EU/（kg·h）；M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)的最大供試品劑量，醒腦靜注射液成人一次最大用量為20 mL，取人體平均體質(zhì)量為60 kg計(jì)算，所以M為20/（60×1）=0.33 mL/（kg·h），計(jì)算得樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L為15 EU/mL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及可靠性實(shí)驗(yàn)[4]：取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，加BET水1 mL溶解，旋渦混合器上混合15 min后，用BET水對(duì)其逐級(jí)稀釋，使其最終濃度分別為2.0、0.5、0.125、0.03125 Eu/mL，每一步稀釋都在旋渦混合器上混合30 s，每一濃度取0.1 mL分別加到預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，立即插入到已設(shè)置好實(shí)驗(yàn)程序的BET-48G細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，每一濃度重復(fù)3管；另取0.1 mL BET水加到預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)做陰性對(duì)照，平行做2管。以反應(yīng)時(shí)間T的對(duì)數(shù)與內(nèi)毒素濃度C的對(duì)數(shù)作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：LgT=3.15299+（-0.38122LgC），|r|=0.9937＞0.980，標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度點(diǎn)λ=0.03125 Eu/mL，陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，故標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

2.3 預(yù)干擾試驗(yàn)

2.3.1 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的計(jì)算[4]：按公式MVD=L× C/λ，L為醒腦靜注射液內(nèi)毒素限值15 Eu/mL，c=1.0 mL/mL，λ=0.03125 Eu/mL，計(jì)算得透析液MVD為480倍。

2.3.2 樣品溶液配制及預(yù)干擾試驗(yàn)：將醒腦靜注射液用BET水稀釋為20、40、80倍，記為Ai；同時(shí)另取3管進(jìn)行同樣倍數(shù)的稀釋，但在稀釋液中添加濃度為0.5 Eu/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液，作為樣品添加內(nèi)毒素陽(yáng)性對(duì)照管，記為Bi。分別取上述各液0.1 mL加到預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，立即插入到已設(shè)置好實(shí)驗(yàn)程序的BET-48G細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定儀進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，每一濃度重復(fù)2管，計(jì)算回收率（%）=（Bi液內(nèi)毒素值-Ai液內(nèi)毒素值）/0.5×100%，結(jié)果見表1。

表1 預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果

由表1可見，樣品添加內(nèi)毒素平均回收率均在50%-200%范圍內(nèi)，符合《中國(guó)藥典》2010年版二部規(guī)定，表明醒腦靜注射液在稀釋倍數(shù)為80以內(nèi)對(duì)試驗(yàn)均無(wú)干擾。經(jīng)分析比較，選擇無(wú)干擾且回收率接近100%的80倍稀釋進(jìn)行測(cè)定。

2.4 干擾試驗(yàn)的驗(yàn)證：為確證醒腦靜注射液80倍稀釋的有效性，進(jìn)行3個(gè)批號(hào)醒腦靜注射液正式干擾試驗(yàn)。按“2.3”項(xiàng)下方法，對(duì)3個(gè)批號(hào)醒腦靜注射液稀釋80倍進(jìn)行干擾試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)2管，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 于擾試驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果

由表2可見，將樣品稀釋80倍，樣品回收率均在有效范圍50%～200%范圍內(nèi)，符合《中國(guó)藥典》2010年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的有關(guān)規(guī)定，表明在該稀釋倍數(shù)下樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾，在這一濃度下測(cè)得的內(nèi)毒素?cái)?shù)值真實(shí)、有效，檢測(cè)醒腦靜注射液時(shí)選用稀釋倍數(shù)為80倍稀釋液即可。

3 討 論

3.1 本文通過(guò)建立定量檢測(cè)醒腦靜注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的試驗(yàn)方法，對(duì)完善該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。經(jīng)過(guò)方法學(xué)試驗(yàn)考察，動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定其內(nèi)毒素含量的方法快速、準(zhǔn)確、可靠。

3.2 試驗(yàn)結(jié)果表明，用動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)醒腦靜注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，當(dāng)稀釋80倍時(shí)，其回收率可達(dá)到50%～200%，表明在該濃度下樣品對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)干擾，可用于醒腦靜注射液內(nèi)毒素的定量檢測(cè)。

3.3 動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)范圍寬，靈敏度高，可對(duì)樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行定量檢測(cè)，反應(yīng)樣品受內(nèi)毒素污染的程度有著不同于凝膠法檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，克服了凝膠法主觀人為判斷等因素的影響，且通過(guò)與凝膠法驗(yàn)證對(duì)比，結(jié)果一致。

[1] 宋燕熙,焦億.醒腦靜注射液臨床應(yīng)用概述[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技,2010,17(5):472.

[2] 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].中藥成方制劑第十七冊(cè).WS3-B-3353-98.

[3] 王梅娟,謝斌.醒腦靜注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2008,5(34):12.

[4] 中國(guó)藥典.二部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010:附錄99-102.

Determination of Bacterial Endotoxin in Xingnaojing Injection by Kinetic Turbidimetry

TANG Qiu-hua, LIN Hui, ZHANG Yi-fan, HUANG Xiang-chang
(Affiliated Quanzhou First Hospital, Fujian Medical College, QuanZhou 362000, China)

ObjectiveTo establish a method to determine the content of bacterial endotoxin in Xingnaojing injection.MethodsKinetic turbidimetric limulus test of bacterial endotoxin were used according to Chp 2010.Results1→100 solution of Xingnaojing injection showed no interference on test and the average recovery was in the range of 50%～200%.ConclusionThis method is rapid, accurate and sensitive.It can be used for bacterial endotoxin test for Xingnaojing injection.

Injection of Xingnaojing; Bacterial endotoxin; Kinetic turbidimetric limulus test

R927.12

B

1671-8194（2014）22-0021-02