王 冉，李小林，李 敏，魏 靜，陳安均，敖曉琳，蒲 彪，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川成都610066)

泡菜是我國(guó)傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品的典型代表之一［1］。傳統(tǒng)四川泡蘿卜借助于老鹽水中的微生物以及天然附著在蔬菜表面上的微生物進(jìn)行發(fā)酵作用，在發(fā)酵過(guò)程中，由于乳酸菌、醋酸菌等微生物的活動(dòng)，會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸、乙酸等有機(jī)酸，這些有機(jī)酸賦予了四川泡蘿卜適宜的酸味，同時(shí)這些有機(jī)酸可以與醇類等其它物質(zhì)相互作用產(chǎn)生酯類等香味物質(zhì)，增加泡蘿卜的風(fēng)味［2］。近年來(lái)，高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于有機(jī)酸的分析中［3－5］，但在泡蘿卜中的研究鮮有報(bào)道。本文試圖建立反相高效液相色譜法分析泡蘿卜中草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸等8種有機(jī)酸的含量，以期對(duì)研究蘿卜泡制過(guò)程中有機(jī)酸等風(fēng)味物質(zhì)的形成與微生物之間的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮蘿卜 購(gòu)于雅安菜市場(chǎng);老泡菜水 收集于學(xué)校周邊飯店。

琥珀酸、草酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸 購(gòu)于美國(guó)化學(xué)試劑公司;乙酸、乳酸、抗壞血酸 購(gòu)于美國(guó)sigma公司;磷酸、磷酸二氫鉀均為分析純 成都市科龍化工試劑廠;甲醇為色譜純 廣東光華科技股份有限公司。

島津LC－20101C高效液相色譜儀 LC solution工作站，UV－VIS檢測(cè)器，日本島津公司;YMC－Pack ODS－AQ C18色譜柱(5μm，120A，4.6mm ×150mm)YMC公司;精密PHS－4C+型酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司;超純水制備儀 四川優(yōu)普超純科技有限公司;KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司;CP225D型電子天平 德國(guó)賽多利斯股份公司。

1.2 方法

1.2.1 泡蘿卜的制備 傳統(tǒng)發(fā)酵泡蘿卜:以紅皮蘿卜為原料，將新鮮的紅皮蘿卜洗凈、晾干，以料液比1∶1用老鹽水泡制，并補(bǔ)鹽至泡菜水鹽濃度為7%，于常溫條件下泡制。

1.2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 有機(jī)酸的單標(biāo)溶液:分別稱取乳酸4.35mg、蘋果酸3.68mg、檸檬酸4.35mg、酒 石 酸 3.40mg、抗 壞 血 酸 2.62mg、草 酸1.10mg、琥珀酸 8.01mg、乙酸 2.35μL，分別用超純水溶解并定容至10mL，于4℃冰箱保存，使用前經(jīng)0.45μm 濾膜過(guò)濾［6］。

有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取適量各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，配制成5mg/mL乳酸、1mg/mL的酒石酸和抗壞血酸，其余酸質(zhì)量濃度為2mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為母液，于4℃冰箱保存。在使用時(shí)，將其依次稀釋為母液濃度的 1、0.2、0.04、0.008、0.0016、0.00032倍，經(jīng) 0.45μm 濾膜過(guò)濾后使用［6］。

1.2.3 色譜條件 YMC－Pack ODS－AQ C18色譜柱(5μm，120A，4.6mm ×150mm);流動(dòng)相為 4% 甲醇－96%的0.05mol/L KH2PO4溶液(用 H3PO4調(diào)節(jié)pH2.9);流速0.6mL/min;柱溫27℃;進(jìn)樣量10μL;檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。

1.2.4 樣品預(yù)處理 準(zhǔn)確稱取已切碎混勻的樣品2.5000g，用超純水定容至50mL，過(guò)濾后取濾液離心(10000r/min，10min)，上清液經(jīng) 0.45μm 濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 在LC solution工作站中，根據(jù)色譜圖中各峰的保留時(shí)間和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定性分析;根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品中有機(jī)酸進(jìn)行定量分析，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)初步確定有機(jī)酸分離色譜分離條件

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 結(jié)果表明抗壞血酸和乙酸的最大吸收分別為242nm和233nm，其余6種有機(jī)酸在210nm處的吸收與204nm處的最大吸收相差不大，綜合考慮抗壞血酸和乙酸的最大吸收波長(zhǎng)，以下實(shí)驗(yàn)均采用210nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.2 色譜柱的選擇 對(duì)于有機(jī)酸的分離，目前國(guó)內(nèi)使用鍵合十八烷基填料(C18)色譜柱的較多［3－8］，實(shí)驗(yàn)中考慮使用 Kromasil 100－5C18色譜柱和 YMCPack ODS－AQ C18色譜柱。由于泡蘿卜中的有機(jī)酸為水溶性物質(zhì)，因此在分離有機(jī)酸時(shí)使用的流動(dòng)相應(yīng)為高比例的水相溶劑。而Kromasil 100－5C18色譜柱以硅膠為基質(zhì)，硅膠在水中的溶解度較流動(dòng)相中高，若長(zhǎng)時(shí)間用純水相或高比例水相沖洗柱子，很容易造成固定相流失，使柱效下降。而YMC－Pack ODS－AQ C18色譜柱是親水性色譜柱，在高含水量甚至純水中對(duì)有機(jī)酸等強(qiáng)極性物質(zhì)具有較強(qiáng)的保留能力。因此，選擇YMC－Pack ODS－AQ C18色譜柱進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 流動(dòng)相種類的選擇 甲醇－水系統(tǒng)和磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)是C18柱中應(yīng)用最廣泛的流動(dòng)相，其中磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)較適宜于有機(jī)酸的測(cè)定［9］。在流速1mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量 10μL，檢測(cè)波長(zhǎng) 210nm的初始色譜條件下，分別用0.05mol/L的 KH2PO4、NaH2PO4、NaHPO4溶液(H3PO4調(diào)節(jié) pH2.5)作為流動(dòng)相對(duì)配制的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離，結(jié)果見(jiàn)圖1，三種磷酸鹽作為流動(dòng)相時(shí)有機(jī)酸的分離效果差別不大，均可以作為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)中選擇KH2PO4作為流動(dòng)相。

2.1.4 流動(dòng)相濃度的選擇 磷酸鹽緩沖液濃度的高低影響酸存在形式的穩(wěn)定性，從而影響分離效果［3］。將流動(dòng)相配制成不同濃度的溶液，其余按照2.1.3的較優(yōu)色譜條件，研究流動(dòng)相濃度對(duì)各酸保留時(shí)間的影響(見(jiàn)圖2)。由圖2可知，流動(dòng)相濃度對(duì)琥珀酸與蘋果酸2以及蘋果酸2與檸檬酸的分離效果影響較大，當(dāng)流動(dòng)相濃度為0.05mol/L時(shí)，它們能較好分離，隨著流動(dòng)相濃度的繼續(xù)增加，其分離效果稍有增強(qiáng)。但由于高濃度的鹽會(huì)對(duì)泵和柱子的壽命產(chǎn)生影響，因此選擇0.05mol/L的KH2PO4溶液進(jìn)行后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)。

圖2 流動(dòng)相濃度對(duì)保留時(shí)間的影響Fig.2 Effect of mobile phase’s concentrations on retention time

2.1.5 流動(dòng)相pH的選擇 有機(jī)酸為弱酸，在水溶液中會(huì)解離，可通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH以達(dá)到抑制解離的作用。將流動(dòng)相調(diào)成不同pH，其余按照2.1.4的較優(yōu)色譜條件，得到流動(dòng)相pH對(duì)有機(jī)酸分離的影響，由圖3可知流動(dòng)相pH對(duì)有機(jī)酸的分離影響很大，其中對(duì)檸檬酸、蘋果酸2的保留時(shí)間影響最大。另外，當(dāng) pH 為2.1、2.3、2.5、2.7、3.1 時(shí)，乳酸和抗壞血酸完全不能分開，僅pH為2.9時(shí)，乳酸和抗壞血酸可以分開，各酸均能較好地分離，因此選擇pH2.9進(jìn)行后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)。

圖3 流動(dòng)相pH對(duì)保留時(shí)間的影響Fig.3 Effects of different pH values on retention time

2.1.6 甲醇添加量的選擇 在流動(dòng)相中加入甲醇可以有效的改善峰形，且對(duì)各有機(jī)酸的出峰時(shí)間也有較大影響［4］。在流動(dòng)相中分別添加不同體積的甲醇，在2.1.5的較優(yōu)色譜條件下，考察甲醇添加量對(duì)有機(jī)酸分離效果的影響。由圖4可知，甲醇添加量為0%時(shí)，各峰的拖尾嚴(yán)重，峰形不好，分析時(shí)間較長(zhǎng)。加入甲醇后，乳酸和抗壞血酸的出峰順序發(fā)生變化，且隨著甲醇含量的增加，有機(jī)酸的疏水基與固定相的相互作用減弱，保留時(shí)間下降，檸檬酸和乙酸的分離度降低;抗壞血酸和蘋果酸1的分離度也逐漸較小，但乳酸和抗壞血酸的分離度增加。當(dāng)甲醇添加量為1%時(shí)，乳酸和抗壞血酸分離度很小;當(dāng)甲醇添加量為3%時(shí)，乳酸和抗壞血酸的分離度較小，但檸檬酸和乙酸的分離度較大;當(dāng)甲醇添加量為5%時(shí)，各酸均能較好分離;當(dāng)甲醇添加量為7%和9%時(shí)，檸檬酸和乙酸已經(jīng)完全不能分開。因此，選擇5%進(jìn)行后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)，選擇3%～5%進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖4 甲醇添加量對(duì)各有機(jī)酸保留時(shí)間的影響Fig.4 Effects of methanol content on retention time

2.1.7 流速的選擇 在2.1.6的較優(yōu)色譜條件下，調(diào)整流動(dòng)相的流速，可知(圖5)流速太高，各酸的保留時(shí)間下降，分離度降低，且柱壓隨著流速的升高而升高，當(dāng)柱壓太高時(shí)，對(duì)柱子的保護(hù)和長(zhǎng)期使用不利。但當(dāng)流速太低時(shí)，各酸的保留時(shí)間明顯增加，分析時(shí)間大大延長(zhǎng)，當(dāng)流速降低到0.2mL/min時(shí)，25min尚未完成對(duì)8種有機(jī)酸的檢測(cè)。綜合分析，選擇0.6mL/min進(jìn)行后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)，選擇0.6～0.8mL/min進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.8 柱溫的選擇 在2.1.7較優(yōu)色譜條件下，改變柱溫，考察柱溫對(duì)有機(jī)酸分離效果的影響，如圖6所示，柱溫對(duì)抗壞血酸、檸檬酸、蘋果酸2和琥珀酸的保留時(shí)間影響較大，且隨柱溫的升高均逐漸減小。隨著柱溫的逐漸升高，乙酸和檸檬酸的分離度逐漸降低，當(dāng)柱溫達(dá)到30℃時(shí)，乙酸和檸檬酸在同一時(shí)間出峰，完全不能分離，繼續(xù)升高柱溫至35℃時(shí)，乙酸和檸檬酸改變出峰順序;而乳酸和抗壞血酸的分離度則隨著柱溫的升高而增大。結(jié)果表明，當(dāng)溫度達(dá)到25℃時(shí)，各酸在10min以內(nèi)可以達(dá)到有效的分離。

圖5 流速對(duì)各有機(jī)酸保留時(shí)間的影響Fig.5 Effects of flow rate on retention time

圖6 柱溫對(duì)各有機(jī)酸保留時(shí)間的影響Fig.6 Effects of column temperature on retention time

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化有機(jī)酸分離色譜分離條件

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)表L9(34)，以流動(dòng)相pH、甲醇添加量、流速和柱溫四個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，采用串行色譜響應(yīng)函數(shù)HCRF［7］作為優(yōu)化指標(biāo)，確定各因素主次，并確定最優(yōu)組合。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表和正交實(shí)驗(yàn)表見(jiàn)表1和表2。

式中:n是色譜峰的數(shù)目，Rs min是最難分離物質(zhì)對(duì)的分離度，T是最后流出色譜峰的保留時(shí)間。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels table of orthogonal test

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由極差分析可知，R越大，表明該因素對(duì)指標(biāo)的影響越大，因此各因素對(duì)有機(jī)酸分離效果的的主次順序?yàn)?流動(dòng)相pH＞柱溫＞甲醇添加量＞流速。最終選擇的最優(yōu)分離條件為:4%甲醇－96%的0.05mol/L KH2PO4(用 H3PO4調(diào)節(jié) pH2.9);流速0.6mL/min;柱溫27℃;進(jìn)樣量10μL;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

圖7和圖8分別是該色譜條件下測(cè)定有機(jī)酸混合標(biāo)液與泡蘿卜中有機(jī)酸的色譜圖，從色譜圖可以看出，泡蘿卜中的8種有機(jī)酸均能得到有效分離，可根據(jù)各酸的保留時(shí)間對(duì)樣品中的有機(jī)酸進(jìn)行初步定性分析。

表2 正交實(shí)驗(yàn)表和極差分析Table 2 The orthogonal test table and range analysis

圖7 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜分離圖Fig.7 Chromatogram of standard organic acids

圖8 泡蘿卜樣品中有機(jī)酸的色譜分離圖Fig.8 Chromatogram of organic acids in pickled radish

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

在上述得到的最優(yōu)條件下，將有機(jī)酸混合標(biāo)樣母液稀釋成6個(gè)濃度梯度的有機(jī)酸溶液，分別以10μL進(jìn)樣，以峰面積 y對(duì)質(zhì)量濃度(x，mg/mL)作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，由表3可知，各有機(jī)酸的相關(guān)系數(shù)在0.99～1.0范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。再以3倍信噪比(S/N)時(shí)各有機(jī)酸的濃度作為最小檢測(cè)限(表3)。

2.4 樣品預(yù)處理方法的優(yōu)化

分別用超純水和流動(dòng)相提取樣品中的有機(jī)酸，根據(jù)提取有機(jī)酸總量的多少選擇較優(yōu)的提取方式。結(jié)果表明，流動(dòng)相和超純水兩種不同提取方式所提取得到的8種有機(jī)酸的總量分別為12.97mg/100g和13.43mg/100g。雖然兩種提取方式的提取結(jié)果相差不大，但由于超純水提取方式更方便，且經(jīng)濟(jì)成本較低，因此本實(shí)驗(yàn)選擇用超純水提取作為樣品的前處理方式。

2.5 精密度和回收率的測(cè)定

取同一樣品5份，分別采用超純水提取有機(jī)酸，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后上樣，用于考察方法的精密度，如表3所示，8種有機(jī)酸的RSD在0.34%～2.18%之間。另取同一樣品4份，1份作為本底，另外3份樣品分別按測(cè)試樣品有機(jī)酸總量的 80%、100%、120%加入有機(jī)酸混合標(biāo)樣，得到各有機(jī)酸的回收率，如表3所示，均在90.59%～103.85%之間。表明該方法準(zhǔn)確靈敏、重現(xiàn)性好、回收率高。

2.6 泡蘿卜樣品中有機(jī)酸的分析

新鮮蘿卜和泡菜樣品按上述得到的最佳樣品預(yù)處理方法處理后，按最佳色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4，在新鮮蘿卜和泡蘿卜中均檢測(cè)出除酒石酸之外的7種有機(jī)酸。草酸是一種廣泛存在于植物中的有機(jī)酸，草酸含量過(guò)多，產(chǎn)品口感發(fā)澀，影響品質(zhì)［10］。蘋果酸和抗壞血酸均有爽快的酸味，但蘋果酸略有苦味［11］。乳酸的酸味柔和，有后酸味，可提供柔和的風(fēng)味［12］。醋酸有較強(qiáng)的刺激味，適量的醋酸，酸味柔和，有強(qiáng)化食欲的功能。檸檬酸爽快可口，能賦予泡蘿卜較好的酸味。琥珀酸的呈味特點(diǎn)是酸和鮮，且琥珀酸的鈉鹽閾值較低，可以賦予產(chǎn)品鮮美的味道［13］。由表4知，使產(chǎn)品具有澀味和苦味的草酸與蘋果酸的含量在蘿卜泡制后減少，而賦予泡蘿卜爽快酸味和鮮味的乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的含量則升高，其中乳酸是泡蘿卜中含量最高的有機(jī)酸。

表3 回歸分析、精密度和回收率、檢測(cè)限Table 3 Regression analysis，precision and recovery，detection limit

表4 蘿卜泡制前后有機(jī)酸的變化(mg/100g)Table 4 Contents of organic acid in pickled radish(mg/100g)

3 結(jié)論

3.1 在實(shí)驗(yàn)中建立了反相高效液相色譜法同時(shí)分析泡蘿卜中8種有機(jī)酸的方法:YMC－Pack ODS－AQ C18 色譜柱(5μm，120A，4.6mm ×150mm)，4%甲醇－96%的0.05mol/L KH2PO4(H3PO4調(diào)節(jié)pH2.9)作為流動(dòng)相，流速0.6mL/min，柱溫27℃，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。在此條件下，8種有機(jī)酸能夠獲得較好的分離，回收率為 90.59%～103.85%，RSD為0.34%～2.18%。該方法具有靈敏度高、測(cè)試組分多、速度快等優(yōu)點(diǎn)，適用于泡蘿卜中有機(jī)酸的測(cè)定。

3.2 實(shí)驗(yàn)比較了超純水和流動(dòng)相提取泡蘿卜中有機(jī)酸的效果，表明超純水提取效果好于流動(dòng)相提取。與孫基梁［14］在采用蒸餾水提取、流動(dòng)相提取以及甲醇提取法提取銀杏果和枸杞中有機(jī)酸時(shí)的結(jié)果一致。另外，賈洪鋒等［3］用加熱提取和超聲波提取方式提取發(fā)酵辣椒中有機(jī)酸，結(jié)果表明加熱提取的效果好于超聲波提取，然而本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的酸中含有抗壞血酸，加熱可能會(huì)造成抗壞血酸的分解，因此實(shí)驗(yàn)中不予加熱。

3.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)泡蘿卜中的8種有機(jī)酸進(jìn)行了定量分析。其中，乳酸是含量最多的有機(jī)酸，其他酸雖然含量相對(duì)較少，但是在泡蘿卜的風(fēng)味形成中同樣具有重要的作用。而酒石酸在新鮮蘿卜和泡蘿卜中均未檢測(cè)到，可能是由于酒石酸含量太少或是草酸影響了酒石酸的檢測(cè)，還需進(jìn)一步研究。

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