華承偉，于江傲，李 蘭，常景玲，張志宏

(河南科技學院生科院，河南新鄉(xiāng)453003)

β-葡萄糖苷酶能夠?qū)⒗w維二糖水解成葡萄糖，從而解除纖維素在酶解過程中產(chǎn)生的纖維二糖對纖維素酶的抑制作用［1］，所以，在纖維素的水解中起著非常重要的作用。β-葡萄糖苷酶也是一類具有重要生理功能的水解酶，能催化氧親合糖基轉(zhuǎn)移的水解酶，在一些條件下可催化芳基、氨基、或烷基-β-D-糖苷以及生青糖苷、短鏈低聚糖和二糖中的糖苷鍵，此外，在特定的條件下會發(fā)生水解的逆反應，生成一些新的糖苷［2］。β-葡萄糖苷酶在食品中不僅可以用于改良果汁風味、果酒增香、茶葉增香、生產(chǎn)大豆異黃酮活性苷元、去除苦澀物質(zhì)［3-4］，而且，可用于酵母提取物的生產(chǎn)和海藻生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)可發(fā)酵葡萄糖，利用其轉(zhuǎn)移活性應用于低聚糖和糖綴合物合成等。此外，在日用化工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)中也有廣泛的用途［5］。

β-葡萄糖苷酶按存在的部位，可分為胞內(nèi)和胞外2種，根據(jù)氨基酸序列相似性，β-葡萄糖苷酶分別隸屬于糖苷水解酶家族1和3［6-7］。家族1中的β-葡萄糖苷酶來自于細菌、植物和哺乳動物，家族3中的β-葡萄糖苷酶主要來自于真菌、細菌和植物。幾乎所有的β-葡萄糖苷酶對底物的糖基部分結構的專一性較差，能裂解 C-O、C-S、C-N、C-F等鍵，有些對糖基部分的C4和C2構形也不專一，能同時水解β-葡萄糖苷鍵和β-半乳糖苷鍵，甚至對C6位的專一性也不高，能夠水解木糖苷［8］。本實驗對分離得到的耐熱真菌擬青霉FLH30進行細胞破碎，并經(jīng)凝膠層析和離子交換得到的電泳級β-葡萄糖苷酶純酶進行性質(zhì)探索，為該酶的基因克隆及利用提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 Paecilomyces sp.FLH30，河南科技學院分離工程實驗室保存。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 酵母提取物10，蛋白胨10，葡萄糖 20，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.3，CaCl20.4，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，pH，自然;酵母提取物、蛋白胨Oxoid公司(英國);大麥葡聚糖、地衣多糖、昆布多糖、木聚糖、pNP-β-D-葡萄糖苷、pNP-α-D-葡萄糖苷、pNP-β-D-半乳糖苷、ONP-β-D-半乳糖苷、纖維二糖、龍膽二糖和乳糖 Sigma公司(美國);纖維寡糖(G3～G4) 自制;丙烯酰胺、甘氨酸、Tris Biomol公司(美國);Sephacryl-S-100HR Pharmacia公司(美國);DEAE52 Whatman公司(英國);低分子量蛋白質(zhì)標準 TaKaRa公司(日本);葡萄糖氧化酶試劑盒 北京北化康泰化學試劑有限公司;其它試劑均為分析純。

超聲波超微細胞破碎儀 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司;TU-1800PC紫外可見分光光度計北京普析通用儀器設備有限責任公司;Power Pac BasicTM型電泳儀 BIO-RAD公司(美國);GL-20B高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;Kieselgel 60層析板 Merck公司(德國);核酸蛋白層析系統(tǒng)上海滬西儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液制備 取搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)5d的培養(yǎng)物，3000r/min離心 10min，去除上清，菌絲體用適量50mmol/L pH6.0的磷酸緩沖液重懸，冰浴條件下超聲(300W)，工作 3s，停 5s，循環(huán) 100 次，破碎液經(jīng)10000r/min 4℃冷凍離心 10min，取上清，即為粗酶液。

1.2.2 酶的純化及分子量檢測 粗酶液經(jīng)Sephacryl-S-100 HR凝膠層析(1×100cm，流速1mL/min)，收集有酶活性的部分，經(jīng)超濾濃縮后，再用50mmol/L pH6.0的 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液透析過夜，經(jīng)DEAE52離子交換(1×10cm，上樣及平衡緩沖液同透析緩沖液，含有100mmol/L NaCl的緩沖液洗滌3～5個柱體積，100～500mmol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫，流速 3mL/min)，1mL/管，分步收集后，SDSPAGE電泳［9］分別檢測酶蛋白純度(分離膠和濃縮膠分別為5%和12.5%)，收集有酶活且純度較高的部分，經(jīng)超濾濃縮和4℃冷凍離心后，取上清4℃保存，作為實驗用酶材料。

Sephacryl-S-100HR凝膠過濾法測定分子量以磷酸化酶B(97.4ku)、牛血清蛋白(66.2ku)、兔肌動蛋白(43.0ku)、牛乳酪蛋白(25.0ku)和細胞色素C(12.4ku)作為標準蛋白。按公式Ve=-b'lgMw+c'，通過lgMw對Ve做圖，從曲線上求出分子量。

1.2.3 蛋白含量測定 參照Lowry等的方法［10］，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。

1.2.4 酶活測定 于試管中加入75μL用蒸餾水配制的 15mmol/LpNPG底物，然后加入 150μL 75mmol/L，pH6.0磷酸檸檬酸緩沖液，混勻，使底物終濃度為5mmol/L，緩沖液濃度為50mmol/L，50℃預熱3min，然后加入25μL適當稀釋的酶液，反應10min后，加入750μL飽和四硼酸鈉溶液終止反應，冷卻后測定A405，以pNP作標準計算酶活力。酶活力的單位定義為:在上述條件下，每分鐘生成1μmol pNP所需要的酶量。

1.2.5 最適反應pH和pH穩(wěn)定性 45℃下，將緩沖液分別換成不同pH及不同體系(Na2HPO4-Citric，2.5 ～ 6.5;NaH2PO4-Na2HPO4，6.0 ～ 8.0;CHES，8.0～11.0;Na2HPO4～NaOH，11.0～12.0;KCl～NaOH，12.0～13.0)的緩沖液加入到底物中，然后按照標準方法測定酶活力，以酶活力最高點作為100%，確定最適pH;用上述不同的pH緩沖液分別稀釋純酶液，將稀釋好的酶液置于25℃水浴鍋中分別處理30min，迅速將樣品置于冰水中冷卻30min，然后測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶液作為對照，計算殘余酶活力的百分比，考查pH穩(wěn)定性。結果為三次實驗數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.6 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 將重組酶適當稀釋于50mmol/L pH6.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中，然后分別在30～70℃不同溫度下按照上述方法測定酶活力。溫度穩(wěn)定性測定:將酶液用50mmol/L pH6.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液稀釋后分別在不同的溫度下處理30min，然后置于冰水浴中冷卻30min，最后按標準的方法測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶液酶活力為100%對照。結果為三次實驗數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.7 金屬離子及化合物對酶活力的影響 在緩沖液為50mmol/L，pH6.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液的酶溶液中分別加入不同的金屬離子，使其終濃度為4mmol/L，將酶液在25℃下處理 30min，然后在50℃條件下測定剩余酶活力，以沒有添加金屬離子的酶液作為對照。結果為三次實驗數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.8 底物特異性 分別以pNP-糖苷、二糖、低聚糖和聚糖為反應底物測定酶活力。pNP-糖苷類底物以水解釋放出 pNP的速率來計算酶活力，采用50mmol/L，pH6.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制5mmol/L濃度的底物，然后在50℃下反應10min，最后測定405nm的吸光度值;低聚糖用50mmol/L，pH6.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制10mg/mL濃度的底物，然后在50℃下反應10min，最后通過檢測水解過程中釋放出葡萄糖的速率來計算酶活力。葡萄糖的濃度采用葡萄糖氧化酶試劑盒測定;聚糖類底物用50mmol/L，pH6.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制成1%(w/v)濃度，然后在50℃下反應10min，最后采用DNS法測定水解過程中釋放的還原糖量。酶活力單位定義為在上述條件下每分鐘反應生成1μmol pNP、葡萄糖或還原糖所需要的酶量。然而，對于低聚糖中的纖維二糖和龍膽二糖，一個酶活力單位為生成2μmol的葡萄糖的量(水解一個糖苷鍵釋放出兩個葡萄糖)。所有的實驗均經(jīng)過三次重復。

1.2.9 聚糖和纖維多糖水解TLC分析 以50mmol/L，pH6.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液配制10%的纖維多糖和1%的大麥葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖，添加10U/mL的重組酶，50℃保溫水解，定時取樣進行薄層層析(TLC，Kieselgel60)分析，展層系統(tǒng)為正丁醇/乙酸/水系統(tǒng)(2∶1∶1，v/v/v)，將水解的樣品點樣后展開兩次，吹干后用硫酸∶甲醇(5∶95，v/v)溶液浸濕，最后在130℃烘箱中烘烤顯色。

2 結果與討論

2.1 糖苷酶純化及分子量測定

經(jīng)Sephacryl-S-100HR凝膠層析和DEAE52離子交換，收集純度較高的部分再經(jīng)SDS-PAGE檢測(上樣10μg)，達到電泳級純酶(圖1)。

圖1 純化β-葡萄糖苷酶SDS-PAGE電泳檢測列Fig.1 Analysis of purified β-glucosidase by SDS-PAGE

微生物胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶一般屬于1家族糖苷水解酶，分子量較小，而胞外糖苷酶大多屬于3家族糖苷水解酶，分子量較大，且由于β-葡萄糖苷酶的糖基化作用，分子量一般在100～250ku之間［11］。SDS-PAGE電泳結果顯示為單一條帶蛋白，分子量在44.3～66.4ku之間，為確定在活性狀態(tài)下該酶的分子量，凝膠過濾法測定了其分子量，根據(jù)凝膠過濾標準蛋白分子量曲線(圖2)，測定活性狀態(tài)下的β-葡萄糖苷酶分子量為57.2ku，對比SDS-PAGE電泳結果，該酶應為1家族糖苷水解酶且為單亞基蛋白。

圖2 凝膠過濾測β-葡萄糖苷酶標準曲線Fig.2 The curve of gel filtration chromatography of standard protein

2.2 最適反應pH和pH穩(wěn)定性

該葡萄糖苷酶的最適pH約為6.0，pH對其活性影響較大，pH低于5.0，嚴重抑制酶活性，在pH4.5時，只有最高酶活的12%，當pH高于6.5時，酶活性也急劇下降(圖3a);該酶在pH5.0～12.0(圖3b)范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，處理30min后，殘余酶活力仍保持在80%以上。

2.3 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在不同溫度下測得酶活性數(shù)據(jù)顯示該酶最適反應溫度60℃左右，超過65℃，酶活性快速下降(圖4a);該酶在70℃以下處理30min非常穩(wěn)定，超過70℃后，酶活性快速喪失，85℃處理30min，只有原酶活性的12.5%。

2.4 金屬離子及化合物對酶活力的影響

圖3 β-葡萄糖苷酶最適pH(a)和pH穩(wěn)定性(b)Fig.3 The optimal pH(a)and pH stability(b)of β-glucosidase

圖4 β-葡萄糖苷酶最適溫度(a)和溫度穩(wěn)定性(b)Fig.4 The optimal temperature(a)and temperature stability(b)of β-glucosidase

部分金屬離子及化合物處理數(shù)據(jù)顯示(表1)，Ag+、Hg2+和Fe3+強烈抑制酶活性，Zn2+有較強的抑制作用。其它金屬離子對酶活沒有顯著的影響。其中，EDTA對酶活沒有顯著影響，表明金屬離子不是酶的必需輔助因子，SDS，DTT和β-巰基乙醇對酶活也沒有顯著影響，說明二硫鍵不是維持酶正常空間構象的必需作用力。

2.5 底物特異性

該胞內(nèi)葡萄糖苷酶具有較寬的底物作用范圍(表2)，對 pNP-(-D-半乳糖苷、ONP-β-D-半乳糖苷和纖維二糖有較高的比活力。此外，對部分聚糖也有水解能力，可以水解地衣多糖、昆布多糖和大麥葡聚糖，但不能水解木聚糖和羧甲基纖維素。該酶作用底物及糖苷鍵型比較廣泛，預示該酶具有較廣的用途。

表2 葡萄糖苷酶底物特異性Table 2 Analysis of substrate specificity of β-glucosidase

表1 金屬離子及其它化合物對β-葡萄糖苷酶的影響Table 1 The metal ions and other chemicals influence on β-glucosidase

2.6 聚糖和纖維多糖水解TLC分析

大麥葡聚糖、昆布多糖、纖維三糖和纖維四糖的水解實驗表明，水解大麥葡聚糖、昆布多糖沒有見到低聚寡糖的生成，產(chǎn)物主要以單糖為主(圖5)，可能以外切的方式作用于這些聚糖;此酶可以完全水解纖維三糖和四糖，在4h后基本完全降解為單糖，同時，水解過程中伴隨著轉(zhuǎn)糖苷作用，這種轉(zhuǎn)糖苷作用在最初的2h內(nèi)較為明顯，1～2h之間在二糖和三糖之間有一新糖生成，可能為龍膽二糖，但隨水解時間增加，逐漸水解為單糖(圖6)。

3 結論

圖5 TLC分析β-葡萄糖苷酶水解大麥葡聚糖和昆布多糖Fig.5 Analysis of β-glucosidase hydrolysis of barley glucan and laminarin by TLC

圖6 TLC分析β-葡萄糖苷酶水解纖維三糖和四糖Fig.6 Analysis of β-glucosidase hydrolysis of cellotriose and cellotraose by TLC

依據(jù)水解底物特異性的不同可將β-葡萄糖苷酶劃分成β-葡萄糖苷酶、纖維二糖酶和具有較寬水解特異性，能夠水解多種不同底物的β-葡萄糖苷酶三類。本擬青霉FLH30為耐熱真菌［12］，胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶作用底物廣泛，應屬于第三類β-葡萄糖苷酶。1家族β-葡萄糖苷酶最適溫度一般在40～50℃之間，該β-葡萄糖苷酶最適溫度60℃，在此溫度下處理30min，酶活損失小于10%，70℃處理30min，酶活損失也小于20%。不同來源β-葡萄糖苷酶pI一般都在酸性范圍內(nèi)(3.5～5.5)，并且差別不大，最適pH也多在酸性范圍內(nèi)且最適作用pH范圍較窄，本β-葡萄糖苷酶最適pH6.0，在pH4.5以下，酶活性急劇下降，但該酶非常耐堿，在pH12.0處理30min后，殘余酶活力仍保持在70%以上，預示該酶在食品、醫(yī)藥、紡織、能源等方面具有較大潛在應用價值。

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