方夏琴,劉盟盟,張秀立,吳一飛,鄭穩(wěn)生

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050)

高效液相色譜法測(cè)定甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體含量及有關(guān)物質(zhì)

方夏琴,劉盟盟,張秀立,吳一飛,鄭穩(wěn)生

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050)

目的 建立高效液相色譜(HPLC)法,檢測(cè)甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體的含量及有關(guān)物質(zhì)。方法Kromasil C18柱,流動(dòng)相A為辛烷磺酸鈉溶液-甲醇(42∶58);流動(dòng)相B為辛烷磺酸鈉溶液-甲醇(4∶96);梯度洗脫,流速為1.2 mL·min-1,柱溫室溫,檢測(cè)波長(zhǎng)268 nm。結(jié)果在選定的色譜條件下,甲磺酸伊馬替尼專(zhuān)屬性良好,在線(xiàn)性范圍1～100 μg·mL-1內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好,r=0.999 1(n=5)。結(jié)論該方法用于檢測(cè)甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體的含量及有關(guān)物質(zhì)準(zhǔn)確、靈敏、可靠。

伊馬替尼,甲磺酸;含量測(cè)定;有關(guān)物質(zhì);色譜法,高效液相

甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate,商品名: Glivec,格列衛(wèi))是一種口服的新型酪氨酸激酶抑制藥。目前已知的主要不良反應(yīng)包括血液學(xué)毒性和非血液學(xué)毒性[1-6]。將甲磺酸伊馬替尼制成脂質(zhì)體,可減少甲磺酸伊馬替尼不良反應(yīng),增加治療應(yīng)用[7]。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中建立測(cè)定甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體含量及有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法,實(shí)驗(yàn)表明該方法專(zhuān)屬性強(qiáng),準(zhǔn)確、靈敏,操作簡(jiǎn)單。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100系列高效液相色譜儀、ChemStation色譜工作站;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA N-1000,日本東京理化器械株式會(huì)社);高壓勻質(zhì)機(jī)(Niro NS2006L,意大利GEA Niro Soavi公司);葡聚糖凝膠G-50顆粒,葡聚糖凝膠柱(40 cm×16 cm)(稱(chēng)取葡聚糖凝膠顆粒5 g,純化水浸泡24 h,濕法裝柱,待用)。

1.2 試藥 大豆卵磷脂(soybean phosphatidylcholine, SPC,北京化學(xué)試劑公司,生化試劑,批號(hào):100708,純度:98%);膽固醇(cholesterol,Chl,北京化學(xué)試劑公司,生化試劑,批號(hào):101012,純度:98%);甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品(加拿大TRC公司標(biāo)準(zhǔn)品,含量>99%,批號(hào):FI10812);甲磺酸伊馬替尼原料藥(北京華威銳科化工有限公司,含量>98.0%,批號(hào):100302);甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所自制,批號(hào):110501,濃度:1.5 mg·mL-1);曲拉通X-100 (北京化學(xué)試劑公司,試劑級(jí),使用時(shí)用乙醇配制成10%的曲拉通溶液,批號(hào):091213,純度≥98%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(150 mm× 4.6 mm,5 μm,Akzo Nobel公司);流動(dòng)相A為辛烷磺酸鈉溶液(取辛烷磺酸鈉7.5 g,加水800 mL使溶解,用10%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.5,加水稀釋至1 000 mL)-甲醇(42∶58);流動(dòng)相B為辛烷磺酸鈉溶液(取辛烷磺酸鈉7.5 g,加水800 mL使溶解,用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5,加水稀釋至1 000 mL)-甲醇(4∶96);室溫,流速1.2 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)268 nm;進(jìn)樣量:10 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相時(shí)間梯度表Tab.1 Gradient program of mobile phase %

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 溶劑1:甲醇-0.1 mol·L-1鹽酸(6∶4)。標(biāo)準(zhǔn)品的溶液配制:取甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品36 mg,精密稱(chēng)定,置于50 mL量瓶,加溶劑1溶解并定容,搖勻。取續(xù)濾液10 μL注入色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6次,主峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不得大于2.0%,甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

1.甲磺酸伊馬替尼圖1 甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品溶液液相色譜圖1.Imatinib mesylateFig.1 HPLCchromatogramofImatinibmesylate reference solution

計(jì)算甲磺酸伊馬替尼主峰峰面積和保留時(shí)間的RSD,分別為0.34%(n=6)和0.76%(n=6),符合相關(guān)要求,系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

2.3 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 吸取空白脂質(zhì)體1 mL置于25 mL量瓶,加入甲醇溶解破乳后,以溶劑1稀釋定容,振搖破乳,即得空白脂質(zhì)體破乳液樣品。

吸取空白脂質(zhì)體1 mL于25 mL量瓶,以適量甲醇破乳后,加入70 μg·mL-1甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋定容,振搖破乳,即得含藥空白脂質(zhì)體樣品。

吸取甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體1 mL置25 mL量瓶中,加入甲醇溶解破乳后,以溶劑1稀釋定容,振搖破乳,即得甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體破乳液樣品。

將上述溶液過(guò)濾后置進(jìn)樣瓶中,取10 μL進(jìn)樣,記錄色譜圖,見(jiàn)圖2～4。

圖2 空白脂質(zhì)體破乳液液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of demulsification solution of liposome

1.甲磺酸伊馬替尼圖3 空白脂質(zhì)體與甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品溶液的液相色譜圖1.Imatinib mesylateFig.3 HPLC chromatogram of liposome and Imatinib mesylate reference

1.甲磺酸伊馬替尼圖4 甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體破乳液液相色譜圖1.Imatinib mesylateFig.4 HPLC chromatogram of demulsification solution of imatinib mesylate

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 用溶劑1配制500 μg·mL-1甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,再用溶劑1稀釋此儲(chǔ)備液制備成濃度為1,5,10,50,100 μg·mL-1對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣10 μL,測(cè)定峰面積。以峰面積(A)為縱坐標(biāo),對(duì)照品濃度(C,μg·mL-1)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線(xiàn)性回歸,回歸方程為:A=30.18C+8.689,r=0.999 1(n=5)。表明甲磺酸伊馬替尼溶液濃度在1～100 μg·mL-1范圍內(nèi),與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密移取9份1 mL空白脂質(zhì)體,分別置9個(gè)10 mL量瓶中,分成3份,第1份各加入50 μg·mL-1甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品溶液8 mL(即含藥40 μg·mL-1),第2份各加入50 μg·mL-1甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品溶液9 mL(即含藥45 μg·mL-1),第3份各加入100 μg·mL-1甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品溶液6 mL(即含藥60 μg·mL-1),再用甲醇溶解振搖破乳后以溶劑1稀釋到刻度,進(jìn)樣10 μL,記錄色譜峰面積,計(jì)算得回收率分別為101.3%,101.9%,100.4%,平均RSD為1.7%。由此可見(jiàn),脂質(zhì)體處方中的輔料對(duì)測(cè)定基本無(wú)干擾。

2.6 方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)品適量,精密稱(chēng)定,加溶劑1制成每毫升中含50 μg的溶液作為重復(fù)性樣品溶液。精密量取10 μL,注入液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6次,以峰面積計(jì)算得RSD為0.24%(n=6)。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 取本品適量,精密稱(chēng)定,加溶劑1制成為每毫升含50 μg的溶液作為供試品溶液。精密量取10 μL,注入液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6次,以峰面積計(jì)算得RSD為0.51%(n=6)。

2.8 供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體適量,甲醇破乳后以溶劑1稀釋至成每毫升含50 μg的溶液,分別在0,2,4,8,12,24 h進(jìn)樣,記錄色譜圖,測(cè)定峰面積得RSD為0.36%,表明本品室溫放置在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 檢測(cè)限和定量限 取“2.4”項(xiàng)溶液逐級(jí)稀釋,按S/N≈10測(cè)得甲磺酸伊馬替尼的定量限為0.06 μg·mL-1,按S/N≈3測(cè)得甲磺酸伊馬替尼的檢測(cè)限為0.02 μg·mL-1。

2.10 含量測(cè)定 取甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體4 mL置100 mL量瓶中,甲醇適量破乳后以溶劑1稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。精密量取10 μL注入液相色譜儀,記錄圖譜。另取甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品,用溶劑1溶解,并稀釋至濃度為0.06 mg·mL-1,同法測(cè)定,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算出脂質(zhì)體中甲磺酸伊馬替尼的含量,結(jié)果4批產(chǎn)品的含量分別為76.32%,75.10%, 80.62%,78.79%,表明均一性較好。

2.11 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定 取甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體40 mL置100 mL量瓶,甲醇適量破乳后用溶劑1稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。取供試品溶液1 mL置100 mL量瓶,用溶劑A稀釋至刻度,作為1%對(duì)照溶液,各精密量取10 μL注入液相色譜儀,調(diào)整儀器靈敏度,使主成分峰的峰高為記錄儀滿(mǎn)量程的20%,記錄色譜至主峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液中各雜質(zhì)峰的峰面積之和,不得大于對(duì)照溶液主峰的峰面積(總雜質(zhì)＜1%),結(jié)果4批產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)總雜質(zhì)分別為0.24%,0.22%, 0.22%,0.21%。

3 討論

采用本方法能準(zhǔn)確測(cè)得甲磺酸伊馬替尼的含量和有關(guān)物質(zhì),專(zhuān)屬性良好,線(xiàn)性關(guān)系、回收率、穩(wěn)定性均能滿(mǎn)足要求。甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體在本方法檢測(cè)條件下,含量達(dá)70%,有關(guān)物質(zhì)亦能滿(mǎn)足要求。

本實(shí)驗(yàn)曾使用了多組流動(dòng)相進(jìn)行篩選,采用的流動(dòng)相主峰分離度較好,峰形尖銳,保留時(shí)間適中,能滿(mǎn)足分析的要求。與其他方法比較,本法將梯度波動(dòng)遠(yuǎn)離主藥保留時(shí)間,使得溶劑峰不干擾主峰的測(cè)定。

經(jīng)本方法測(cè)得的甲磺酸伊馬替尼脂質(zhì)體含量較高,制劑的有關(guān)物質(zhì)能得到有效控制。

[1] BENJAMIN R S,RANKIN C,FLETCHER C,et al.PhaseⅢdose-randomized study of imatinib mesylate(ST1571)for GIST:intergroup S0033 early results[J].Proc Am Soc Clin Oncol,2003,22(12):A3271.

[2] JOENSUU H,ROBERTS P,SARLOMO-RIKALA M,et al. Effect of the tyrosine kinase inhibitor ST1571 in a patient with metastatic gastrointestinal stromal tumor[J].N Engl J Med,2001,344(14):1052-1056.

[3] VANOOSTEROM A T,JUDSON I R,VERWEIJ J,et al. Update of phase I study of imatinib(ST1571)in advanced soft tissue sarcomas and gastrointestinal stromal tumors:a report of the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group [J].Eur J Cancer,2002,38(Suppl 5):S83-S87.

[4] DEMTRI G D,VON MEHREN M,BLANKE C D,et al. Efficacy and safetyofimatinibmesylateinadvanced gastrointestinal stromal tumors[J].N Engl J Med,2002, 347(7):472-480.

[5] DRUKER B J,TALPAZ M,RESTA D J,et al.Efficacy and safety of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in chronic myeloid leukemia[J].N Engl J Med,2001,344 (14):1031-1037.

[6] DRUKER B J,SAWYERS C L,KANTARJIAN H,et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acutelymphoblasticleukemiawiththePhiladephia chromosome[J].N Engl J Med,2001,344(14):1038-1042.

[7] LIAN T,HO R J.Trends and developments in liposomes drug delivery systems[J].J Pharm Sci,2001,90(6):667-680.

DOI 10.3870/yydb.2014.11.026

Determination of Imatinib Mesylate Liposome and Related Substances by HPLC

FANG Xia-qin,LIU Meng-meng,ZHANG Xiu-li,WU Yi-fei,ZHENG Wen-sheng
(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing City Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Novel Formulations,Beijing 100050,China)

ObjectiveTo establish a method for determination of imatinib mesylate liposome and related substances.MethodsThe liquid chromatography was carried out on a Kromasil C18column.The mobile phase A consisted of methanoloctane sulfonate solution(42∶58).The mobile phase B consisted of methanol-octane sulfonate solution(4∶96).The flow rate of gradient elution was 1.2 mL·min-1.The detection wavelength was 268 nm.The column temperature was room temperature.ResultsThe intermediates and degraded substances could be seperated under the selected chromatographic conditions.Imatinib mesylate showed a good linear relationship within 1-100 μg·mL-1,r=0.999 1(n=5).ConclusionThe method is specific, accurate,sensitive,and simple,and can be used for quality control of imatinib mesylate liposome.

Imatinib,mesylate;Determination;Related substances;HPLC

R979.1;R927.2

B

1004-0781(2014)11-1495-03

2013-09-09

2013-10-22

方夏琴(1986-),女,安徽潛山人,碩士,主要研究方向:藥物傳輸技術(shù)與新型制劑。電話(huà):010-63165233,E-mail:fangxiaqin@163.com。

鄭穩(wěn)生(1966-),男,安徽潛山人,研究員,博士,主要研究方向:藥物傳輸技術(shù)與新型制劑。電話(huà):010-63165233,E-mail:zhengwensheng@imm.ac.cn。