袁秀芝,許明旺,薛存寬

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院藥劑科,武漢 430077)

不同產(chǎn)地纈草中總環(huán)烯醚萜類的含量比較*

袁秀芝,許明旺,薛存寬

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院藥劑科,武漢 430077)

目的 建立測(cè)定總環(huán)烯醚萜類含量的方法,比較不同產(chǎn)地纈草中總環(huán)烯醚萜類的含量。方法采用分光光度法,以纈草中總環(huán)烯醚萜類與堿性羥胺-高氯酸鐵顯色劑產(chǎn)生顯色反應(yīng),于波長(zhǎng)約522 nm處測(cè)定吸光度,按纈草三酯來(lái)計(jì)算總環(huán)烯醚萜類含量。結(jié)果纈草三酯量在0.05～1.40 mg范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系,平均加樣回收率98.50%,RSD=1.02%,不同產(chǎn)地纈草中總環(huán)烯醚萜類的含量有明顯差異。結(jié)論該方法準(zhǔn)確可靠,能更好地評(píng)價(jià)纈草的質(zhì)量,提示纈草中總環(huán)烯醚萜類的含量與產(chǎn)地有關(guān)。

纈草;總環(huán)烯醚萜類;纈草三酯;分光光度法

纈草是敗醬科纈草屬植物纈草(Valeriana officinalisL.)的根及根莖,主要含有揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜類[1-2]。藥理實(shí)驗(yàn)表明其具有鎮(zhèn)靜安神、解痙鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)等廣泛的藥理活性[3-5]。已被20多個(gè)國(guó)家的藥典所收載,為目前歐洲銷售額最高的天然藥物之一；同時(shí)其又是一種用于食品、化工等行業(yè)的珍貴香料,具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)纈草廣泛分布于湖北、貴州、四川等地,品質(zhì)不一[6-7]。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)主要對(duì)纈草的生理活性和藥理作用進(jìn)行研究,筆者未見對(duì)其化學(xué)成分及其含量分布的報(bào)道。因此,筆者將纈草的主要有效成分總環(huán)烯醚萜類作為該藥的質(zhì)控指標(biāo),采用堿性羥胺-高氯酸鐵顯色方法來(lái)測(cè)其含量,比較不同產(chǎn)地纈草中總環(huán)烯醚萜類的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-4802H型紫外-可見分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司),BS110S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司),超聲清洗器(上海超聲波儀器廠)。

1.2 試藥 纈草購(gòu)自主產(chǎn)區(qū)湖北神農(nóng)架、貴州、四川等地,由中美聯(lián)合神農(nóng)架植被考察隊(duì)鑒定確認(rèn),中國(guó)科學(xué)院武漢植物研究所復(fù)核。對(duì)照品纈草三酯購(gòu)自英國(guó)Apin Chemicals Limited公司,批號(hào):28258。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 顯色試劑的配制 堿性羥胺溶液的配制:稱取鹽酸羥胺2 g,置50 mL量瓶中,加水2.5 mL溶解并以無(wú)水乙醇加至刻度,搖勻即為A液；另稱取氫氧化鈉4 g,置50 mL量瓶中,加水2.5 mL溶解并以無(wú)水乙醇加至刻度,搖勻即得B液。臨用時(shí)將A、B液等量混合,離心取上清液。

高氯酸鐵溶液的配制:稱取高氯酸鐵2.5 g,置于50 mL量瓶中,加入冷藏的水和高氯酸溶液各5 mL使溶解,再用冷藏的無(wú)水乙醇稀釋至刻度,搖勻。臨用前取該溶液2 mL置于50 mL量瓶中,用高氯酸滴至顏色消失,再用冷藏的無(wú)水乙醇稀釋至刻度,搖勻即可。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取纈草三酯對(duì)照品適量用苯溶解稀釋成濃度為1 mg·mL-1。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取干燥纈草粗粉適量,加入5倍量的苯超聲提取3次,每次20 min,合并提取液,濾液揮干,所得提取物用苯定量制成每毫升溶液相當(dāng)于纈草40 mg。

2.1.4 陰性對(duì)照液的制備 將制備供試品溶液所用的藥渣再按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備即可。

2.1.5 總環(huán)烯醚萜類顯色溶液的制備 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照液各1 mL分別置于5 mL量瓶中,加入堿性羥胺溶液1 mL,混勻,置40℃加熱15 min,取出冷卻后加入高氯酸鐵溶液2.5 mL,并用苯加至刻度,搖勻,靜置20 min,備用。

2.1.6 測(cè)定波長(zhǎng)的確定 分別取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照顯色溶液置紫外可見分光光度儀中于200～700 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示供試品和對(duì)照品溶液在約522 nm處有最大吸收峰,而陰性對(duì)照液在此沒(méi)有吸收峰出現(xiàn),說(shuō)明纈草中除環(huán)烯醚萜外其他成分對(duì)總環(huán)烯醚萜類的含量測(cè)定無(wú)干擾,故選擇(522±2)nm,見圖1。

圖1 5種溶液的紫外可見分光光度圖譜1.空白液;2.供試品;3.對(duì)照品;4.未顯色的對(duì)照品;5.未顯色的供試品Fig.1 UV-VIS Spectrophotometry of five kinds of solution1.blank solution;2.sample;3.reference substance;4.the reference substance with no-coloration;5.sample with no-coloration

2.2 線性關(guān)系的考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.00, 0.05,0.10,0.20,0.40,0.80,1.0 0,1.40 mL分別置于5 mL量瓶中,按“2.1.5”項(xiàng)制備方法制成顯色液,并平行做空白對(duì)照,置紫外可見分光光度計(jì)下于(522± 2)nm處測(cè)定吸光度,根據(jù)對(duì)照品量(X)與吸光度(Y)計(jì)算回歸方程為Y=0.000 42+0.496 5X,r=0.999 9。結(jié)果顯示纈草三酯量在0.01～0.28 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品液1.0 mL,依法制成顯色溶液,連續(xù)測(cè)定6次,測(cè)得平均吸光度為0.496 3,RSD為0.07%。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試液1.0 mL,依法制成顯色溶液,分別于0.0,1.0,2.0,3.0,3.5,4.0 h依次測(cè)定吸光度,平均吸光度為0.3358,計(jì)算RSD為1.60%。結(jié)果表明,供試品顯色溶液在常溫下4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批樣品6份,依法制成顯色溶液,置紫外可見分光光度計(jì)下于(522±2)nm處測(cè)定吸光度,RSD為0.94%。

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 平行取已知含量的纈草粗粉6份,精密稱定,分別加入一定量的纈草三酯對(duì)照品,照供試品溶液和顯色液制備法處理后,并平行做空白對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照,置紫外可見分光光度計(jì)下于(522± 2)nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率98.50%,RSD=1.02%。見表1。

表1 纈草三酯加樣回收率Tab.1 Results of recovery test of valepotriate mg

2.7 不同產(chǎn)地樣品的含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地的纈草樣品,按供試品溶液和顯色液制備法處理后,并平行做空白對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照,置紫外分光光度計(jì)下于(522± 2)nm處測(cè)定吸光度,按纈草三酯計(jì)算每克生藥含有總環(huán)烯醚萜類的量。結(jié)果見表2。

3 討論

纈草中環(huán)烯醚萜類成分有許多,其對(duì)照品難以購(gòu)得,不能用高效液相色譜(HPLC)法一一測(cè)定,且纈草三酯在纈草中的相對(duì)含量較低,不能真實(shí)反映纈草的質(zhì)量。環(huán)烯醚萜類能與鹽酸羥胺-高氯酸鐵顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng),新的生成物在約522 nm有最大吸收峰,而其他成分在此無(wú)干擾,故可以選擇此法測(cè)定纈草中總環(huán)烯醚萜類的含量,更有效地控制藥材的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示神農(nóng)架和貴州纈草總環(huán)烯醚萜類含量較高,新疆纈草含量最低。

表2 不同產(chǎn)地纈草含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Content determination of valerian from different origins n=3

供試品制備方法的選擇:首先是供試品溶劑選擇,甲醇、乙醇與顯色試劑有顯色反應(yīng)(棕紅色),最大吸收峰在476 nm處,對(duì)實(shí)驗(yàn)有干擾；二氯甲烷、苯與顯色試劑無(wú)顯色反應(yīng),環(huán)烯醚萜的二氯甲烷或苯溶液顯色反應(yīng)后呈紫紅色,最大吸收峰在(490±2)nm(二氯甲烷)、(522±2)nm(苯)處無(wú)干擾峰,尤以苯為佳,故選定苯作為供試品溶劑。其次是顯色反應(yīng)的水浴溫度及反應(yīng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響:溫度過(guò)高(＞45℃),溶劑易揮發(fā),顯色反應(yīng)不完全,溫度過(guò)低(＜30℃),使顯色反應(yīng)時(shí)間大大延長(zhǎng),35～40℃顯色反應(yīng)比較理想；水浴時(shí)間15～30 min顯色反應(yīng)比較理想,繼續(xù)延長(zhǎng)水浴時(shí)間并不能增加顯色反應(yīng)的強(qiáng)度；加入顯色劑高氯酸鐵溶液后搖勻靜置10～20 min顯色反應(yīng)即達(dá)穩(wěn)定。據(jù)此確定了供試品的制備方法。

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.033

Comparation of Total Iridoids in Valerian from Different Habitats

YUAN Xiu-zhi,XU Ming-wang,XUE Cun-kuan
(Department of Pharmacy,Liyuan Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430077,China)

Objective To determine and compare the contents of total iridoids in valerian from different origins.MethodsThe total iridoids in valerian was detected by reaction with alkaline hydroxylamine-perchloric acid iron reagent,and the absorbance was measured at 522 nm by spectrophotometry.ResultsThe content of valepotriate and its absorption were linear within the range of 0.05-1.40 mg·mL-1.The average recovery was 98.50%,and RSD was 1.02%.There was significant difference between the contents of iridoid in valerian from different habitats.ConclusionThis method is accurate and reliable for evaluating the quality of valerianand.The contents of valeriana is related to its habitats.

Valerian;Total iridoids;Valepotriate;Spectrophotometry

R282.71;R927.2

B

1004-0781(2014)09-1227-03

2013-07-09

2013-09-29

*國(guó)家重大攻關(guān)項(xiàng)目(96-901-01-66)

袁秀芝(1966-),女,湖北麻城人,副主任藥師,碩士,主要從事中藥研究,電話:027-86793046,E-mail:lglx2004 @tom.com。

許明旺(1964-),女,湖北黃石人,主任藥師,碩士,從事中藥研究。電話:027-86793062,E-mail:xuecunkuan@ 163.com。