趙靈芝，張小清，苗延青，鄧文婷，胡顥

(西安醫(yī)學院藥學院，陜西西安 710021)

邏輯生物傳感器(LB)是以蛋白質、DNA、酶以及整個活細胞為分子識別單元，通過生化反應方式進行信息輸入，通過布爾邏輯運算對信息進行處理和加工，然后輸出信息的裝置。與傳統生物傳感器不同，智能化的邏輯生物傳感器不是通過輸入信號和輸出信號一對一的定量響應模式來實現檢測和分析的目的［1-3］，它可以在復雜體系中，通過布爾邏輯運算向生物計算系統編程，從而同時反映多種目標物的存在以及相互間的關系。生物燃料電池(BFC)是指以酶或微生物作為催化劑，通過生物電化學途徑將生物物質的化學能轉化為電能的裝置，其可作為自供電能源發(fā)展為植入式微型人工電子器件［4-7］?；谏锶剂想姵匕l(fā)展的智能邏輯生物傳感器將兩者的優(yōu)點相結合，可發(fā)展為智能化、微型化、不需外接電源的分析裝置，已初步應用于醫(yī)學檢測、診斷以及藥物的控釋研究中［8-11］。本文重點綜述近5年基于BFC發(fā)展的邏輯生物傳感器的工作原理和研究進展［12-19］。

1 基于封閉效應的自供電邏輯生物傳感器

基于封閉效應發(fā)展的自供電邏輯生物傳感器，往往在BFC兩極修飾適配子或脫氧核酶等具有識別能力的生物大分子，在多種目標物處于某種存在狀態(tài)時，它們在電極表面可自由伸展，不阻礙電極表面的電子傳遞;一旦目標物達到特定的存在狀態(tài)時，適配子或脫氧核酶與相應的目標物結合，形成復合物，吸附于電極表面，從而使兩極電子傳遞受到不同程度的抑制，表現出BFC各電化學參數的變化。這種邏輯傳感器以幾種目標物的存在狀態(tài)(如無目標物存在、單一目標物存在、目標物均存在等)為輸入信號Input，以電池的電化學參數達到某一定值作為輸出信號Output，基于電極表面的封閉效應來設計邏輯關系，從而構建不同邏輯關系的自供電傳感器。2010年，董紹俊等［12］報道了首個基于封閉效應適配子邏輯體系控制的生物燃料電池，并以此發(fā)展了自供電邏輯生物傳感器(見圖1)。電池兩極均以氧化銦錫為基底電極，陽極通過自組裝膜將葡萄糖氧化酶(GOD)和凝血酶適配子(TBA)修飾于電極表面;陰極以同樣的方式，將膽紅素氧化酶(BOD)和溶解酵素適配子(LBA)修飾于電極表面;整個電池是以葡萄糖為燃料，以羧酸二茂鐵(FMCA)為兩極的電子介體，通過陽極GOD催化葡萄糖氧化和陰極BOD催化O2還原產生輸出電流。當凝血酶存在、溶解酵素不存在于體系中時，即輸入信號Input(1，0)，陽極TBA可特異性結合凝血酶，形成蛋白復合物，封閉了電極表面，從而阻礙電極表面電子傳遞，使GOD催化葡萄糖氧化產生過電位，降低電池的開路電位;凝血酶的存在并沒有影響陰極的電化學反應，從而沒有造成電池開路電位大幅度下降，即輸出信號 Output 1(開路電位 ＞0.05 V為 Output 1，＜0.05 V為Output 0);同樣當體系中存在目標物溶解酵素而不存在凝血酶時，即Input(0，1)，也不會使電池開路電位的大幅度下降;只有當目標物凝血酶和溶解酵素均存在于體系中時，即Input(1，1)，由于蛋白復合物封閉了兩極造成電池開路電位的大幅度下降，即Output 0;也就是當體系處于Input(0，0)、Input(1，0)和 Input(0，1)3 種狀態(tài)下，Output均為1;只有體系處于 Input(1，1)，Output為0。董紹俊組首次提出適配子與生物燃料電池之間的“互惠”概念，即基于適配子的邏輯生物信號作為控制生物燃料電池能量的輸出及生物燃料電池作為適配子的傳感器。相對于傳統傳感器，這個體系的特征對應于“與非”邏輯門，可用于分析在單一體系中兩種目標物是否同時存在，并可智能化檢測復雜樣品中各種物質間的關系。隨后，他們組［13］基于封閉效應發(fā)展了適配子具有重置功能的自供電式傳感器，整個裝置通過生物物質作為輸入信號，通過簡單的處理方式可使體系重置來達到多次使用的目的，并成功應用于智能化檢測人血清中凝血酶和ATP。但這個裝置的不足之處在于BFC較低的輸出電壓和功率，限制了裝置的實際應用，或可通過電池兩極電子介體的選擇和改進來完善這一裝置。

圖1 模仿布爾“與非”邏輯門的適配子邏輯體系控制的生物燃料電池示意圖［12］Fig.1 Schematic illustration of the assembled aptamer-based BFC logically controlled by biochemical signals that mimicks a boolean NAND logic gate

Katz等［14］基于封閉效應，發(fā)展了自供電生物分 子鍵盤鎖安全系統(見圖2)，電池陽極設計了3個連鎖的酶催化反應，最終將燃料葡萄糖氧化為葡萄糖酸，從而使整個體系pH從最初6.7降至4.2，電池陰極表面修飾了聚-4-乙烯基吡啶(P4VP)，當體系pH＞5.5時，聚合物P4VP呈現疏水收縮狀態(tài)封閉電極表面，阻礙電子介體鐵氰化鉀［Fe(CN)6］3－在電極表面的電子傳遞，即Output 0;當體系pH＜4.5時，聚合物P4VP的吡啶基發(fā)生質子化呈現帶正電的親水溶脹狀態(tài)，不再阻礙電子介體在電極表面的電子傳遞，從而使BFC兩極構成回路，有最大輸出功率即Output 1;這個邏輯體系的輸入信號設計在電池陽極，以3個連鎖化學反應的催化劑酶為Input A、Input B和Input C，體系只有當3種酶依次出現A-B-C，并逐個完成催化反應，才能使體系pH降至4.5以下;其他5種輸入信號C-B-A、A-C-B、B-CA、B-A-C、C-A-B，因陰極沒有電子傳遞，無功率輸出，即Output 0。這個多酶控制的鍵盤鎖安全系統以生物分子酶的正確排列為輸入密碼，以電池有最大功率輸出為正確通過狀態(tài)，可用于構建生物計算機的密碼驗證安全系統;另一方面，也可作為自供電邏輯傳感器用于智能化分析體內多種酶及其相互間的關系研究。

圖2 基于pH控制的生物燃料電池發(fā)展的鍵盤鎖安全系統原理示意圖［14］Fig.2 The pH-switchable biofuel cell for“reading”the output signals generated by the keypad lock system

2 基于底物效應的自供電邏輯生物傳感器

由于酶型BFC以酶的底物作為電池兩極的生物燃料，所以電池的電化學參數均與多種底物的存在狀態(tài)呈現某種邏輯關系，而自供電邏輯生物傳感器大都通過輸出電流，或開路電位以及輸出功率等這些電化學參數達到某一定值作為輸出信號Output，基于此，研究者可設計多種底物關系控制的邏輯體系，并以此發(fā)展基于BFC的自供電式邏輯傳感器。董紹俊組［15］基于底物O2控制的BFC，發(fā)展了酶邏輯體系控制的傳感系統(見圖3)，電池陽極通過GOD催化葡萄糖氧化，陰極通過BOD催化O2還原來構成回路輸出電流，分別以羧酸二茂鐵FMCA和 2，2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸)(ABTS)為電子介體;O2作為陰極BOD的底物即陰極的燃料，其濃度的增加可促使電池陰極還原電流增大，而O2作為陽極GOD催化葡萄糖氧化的電子受體，其與電子介體FMCA屬于競爭關系，隨著O2濃度的增加，電池陽極氧化電流減小;所以當體系中O2濃度達到適中值，即空氣飽和狀態(tài)(O2達21%)時，電池有最大功率輸出，O2濃度達到極高值或極低值均能影響電池功率的輸出。整個邏輯體系以通入O2和通入N2作為Input A和 Input B，構建了“與”門和“非”門邏輯體系控制的BFC，并成功應用于體液中溶解O2的檢測。隨后，董紹俊組［16］以底物O2作為邏輯體系輸入信號，為模擬體內血液流動的動態(tài)過程，將攪拌溶液作為另一個輸入信號，建立了能同時檢測血液中含氧量以及判斷血流是否通暢的自供電邏輯傳感裝置。此類氣體控制的邏輯傳感器具有以下優(yōu)勢:其一，以氣體作為輸入信號控制整個體系，操作更方便;其二，利用通入不同氣體來改變體系的初始態(tài)，從而快速簡易地實現兩種邏輯門體系間的轉換;其三，基于無隔膜單極室的BFC，將兩極催化劑酶固定在電極上，反應所需酶的量很少，并可發(fā)展作為一體化的裝置應用于在醫(yī)學診斷中。

圖3 空氣、氧氣、氮氣影響生物燃料電池輸出功率的作用機制［15］Fig.3 Effect of air，O2，or N2on the power output of the BFC based on GOD/OMCs-FMCA-bioanode and BOD/OMCs-ABTS-biocathode

Zhou等［17］基于底物效應，將BFC技術與生物邏輯體系結合，發(fā)展了集病理性生物標志物檢測、病情診斷、藥物控釋為一體的自供電智能應答體系，將其應用于腹外傷病理模型中藥物的控釋研究。電池陽極通過乳酸脫氫酶(LDH)催化乳酸(LA)氧化，陰極通過O2的還原輸出電流，將LDH和LA作為Input A和Input B。研究者巧妙地在電池陰極固定包載藥物乙酰胺酚的導電聚合物，當體系處于以下3種狀態(tài) Input(0，0)、Input(0，1)、Input(1，0)時，即LDH和LA都不存在或僅存在一種，這代表正常的生理狀態(tài)，整個電池體系均無輸出電流，即Output 0，從而藥物依然包載于導電聚合物中;只有當體系處于Input(1，1)，即LDH和LA都存在，這代表缺血缺氧等病理狀態(tài)，電池電路才有電流的輸出Output 1，從而導致導電聚合物將包載藥物釋放到體系中。這個體系通過陽極內置的邏輯體系控制BFC的功率輸出，可進一步應用于醫(yī)療保健和臨床診斷相關的智能化藥物釋放體系中，但體系仍存在一些需要改進的地方，如增強邏輯體系的診斷能力、減少復雜體系的干擾、增大BFC輸出功率等。

Wang等［18］基于底物效應發(fā)展了脫氧核酶邏輯體系控制的生物燃料電池，并以此發(fā)展了自供電邏輯生物傳感器，體系特征對應于“抑制”門，可用于反映病理環(huán)境中多種目標物間的抑制關系。此項研究的創(chuàng)新之處在于將DNAzymes活性用于邏輯關系的構建，伴隨著現代生物技術的高速發(fā)展，多種底物的DNAzymes均很容易得到，所以可進一步發(fā)展為反映生理環(huán)境中多種具有DNAzymes的目標物(如凝血酶、溶解酵素、K+等)之間關系的邏輯生物傳感體系。

3 基于基因調控的自供電邏輯生物傳感器

Angenent等［19］報道了基因調控邏輯體系控制的微生物燃料電池(MFC)，以此發(fā)展了自供電“與”門生物傳感器。是以綠膿桿菌lasI/rhlI基因片段調控的兩種高絲氨酸內酯作為Input A和Input B，當兩者同時存在于體系，即Input(1，1)，啟動菌群密度感應系統調控體系產生電活性吩嗪，從而使MFC有最大電流的輸出Output 1。細菌代謝反應涉及到復雜的基因調控和蛋白質調控網絡，研究者利用其中一種信號轉導關系發(fā)展的邏輯生物傳感器，可用于實時監(jiān)控致病菌群的變異和感染情況。此外，相信基于MFC發(fā)展的邏輯傳感器，可通過菌群種類和菌群涉及的多種信號轉導關系的選擇，進一步應用于智能化控制污水處理和發(fā)酵等工作。

4 結束語

自2010年首個適配子邏輯體系控制的生物燃料電池構建以來，研究者們將生物邏輯體系與生物燃料電池的優(yōu)勢相結合，基于不同效應構建了多種功能性的邏輯生物傳感器，普遍具有智能化、微型化、裝置一體化、不需要外接電源等優(yōu)點，已初步應用于反映多種目標物的存在以及智能化檢測復雜樣品中各物質間的關系。這種智能化的傳感器屬于生物計算領域，是以生物分子作為輸入信號，所以可以基于多種生化反應來構建不同的邏輯體系。但同時也存在著一些局限，此類智能傳感器研究的生理活性物質往往不是臨床醫(yī)學中關鍵的生物標志物，也尚不能適用于反映特殊環(huán)境下(如生理、病理等)的多種目標物，仍需進一步合理設計傳感器的邏輯體系，尋找適宜的生化反應，并以此構建重要生物標志物的邏輯智能體系，或許生物體復雜的信號網絡是解決這一問題的可靠途徑。此外，生物燃料電池較低的輸出電壓和功率，也限制了這種自供電裝置的實際應用，研究者或可通過改進電池兩極電子介體和兩極物質的固定方式來完善這一問題。最終將這種基于生物燃料電池發(fā)展的智能邏輯生物傳感器廣泛用于臨床醫(yī)學檢測和診斷以及多種病理環(huán)境下藥物的控釋中。

［1］Wang J.Electrochemical glucose biosensors［J］.Chem Rev，2007，108(2):814-825.

［2］Zhou M，Dong S.Bioelectrochemical interface engineering:Toward the fabrication of electrochemical biosensors，biofuel cells，and self-powered logic biosensors［J］.Acc Chem Res，2011，44(11):1232-1243.

［3］Campuzano S，Wang J.Nanobioelectroanalysis based on carbon/inorganic hybrid nanoarchitectures［J］.Electroanalysis，2011，23(6):1289-1300.

［4］Barton S C，Gallaway J，Atanassov P.Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices［J］.Chem Rev，2004，104(10):4867-4886.

［5］Heller A.Miniature biofuel cells［J］.Phys Chem Chem Phys，2004，6(2):209-216.

［6］Kim J，Jia H，Wang P.Challenges in biocatalysis for enzyme-based biofuel cells［J］.Biotechnology Advances，2006，24(3):296-308.

［7］Arnaud A，Montoro G，Analog C.Fully integrated signal conditioning of an accelerometer for implantable pacemakers［J］.Analog Integrated Circuits and Signal Processing，2006，49(3):313-321.

［8］Wang J，Katz E.Digital biosensors with built-in logic for biomedical applications——biosensors based on a biocomputing concept［J］.Anal Bioanal Chem，2010，398(4):1591-1603.

［9］Szacilowski K.Digital information processing in molecular systems［J］.Chem Rev，2008，108(9):3481-3548.

［10］Katz E，Privman V.Enzyme-based logic systems for information processing［J］.Chem Soc Rev，2010，39(5):1835-1857.

［11］Wang J，Katz E.Digital biosensors with built-in logic for biomedical applications［J］.Isr J Chem，2011，51(1):141-150.

［12］Zhou M，Dong S，Wang E，et al.Aptamer-controlled biofuel cells in logic systems and used as self-powered and intelligent logic aptasensors［J］.J Am Chem Soc，2010，132(7):2172-2174.

［13］Zhou M，Dong S，Wang E，et al.An IMP-Reset gate-based reusable and self-powered“smart”logic aptasensor on a microfluidic biofuel cell［J］.Lab Chip，2010，10(21):2932-2936.

［14］Halamek J，Tam T K，Katz E，et al.Self-powered biomolecular keypad lock security system based on a biofuel cell［J］.Chem Commun，2010，46(14):2405-2407.

［15］Zhou M，Wang F，Dong S，et al.Boolean logic gates based on oxygen-controlled biofuel cell in“one pot”［J］.Electrochimica Acta，2011，56(11):4112-4118.

［16］Zhou M，Zheng X，Dong S，et al.‘Non-destructive’biocomputing security system based on gas-controlled biofuel cell and potentially used for intelligent medical diagnostics［J］.Bioinformatics，2011，27(3):399-404.

［17］Zhou M，Zhou N，Wang J，et al.A self-powered“Sense-Act-Treat”system that is based on a biofuel cell and controlled by boolean logic［J］.Angew Chem Int Ed，2012，51(11):2686-2689.

［18］Zhou M，Kuralay F，Wang J，et al.DNAzyme logic-controlled biofuel cells for self-powered biosensors［J］.Chem Commun，2012，48(32):3815-3817.

［19］Li Z，Katz E，Angenent L T，et al.Bacteria-based AND logic gate:A decision-making and self-powered biosensor［J］.Chem Commun，2011，47(11):3060-3062.