蘇玉玲，劉雯，田波，*，馮志彪

（1、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

乳清蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，是國(guó)際上公認(rèn)的人體最優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑之一[1]。其不僅容易消化，且具有較高的生物活性。大量研究表明，通過(guò)酶解乳清蛋白，不僅可以改善其功能特性，且在水解過(guò)程中能釋放許多有著特殊生物活性的肽段。因此，有目的地控制乳清蛋白的水解進(jìn)程，可獲得不同分子量的小肽，對(duì)于開(kāi)拓乳清蛋白的應(yīng)用具有重要意義[2]。

蛋白質(zhì)的水解度（Degree of hydrolysis, DH）是衡量蛋白質(zhì)水解程度的一個(gè)重要指標(biāo)[3]和重要性狀參數(shù)，用于評(píng)價(jià)蛋白肽腱的斷裂的情況以及肽的平均分子量的變換。蛋白的水解程度與蛋白功能特性的改善或是釋放出某種生理功能的生物活性肽有很大關(guān)系。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中所有的水解并非要達(dá)到最大的水解度最有益，有限水解對(duì)改善含蛋白質(zhì)體系質(zhì)構(gòu)特征的加工藝技術(shù)的研究有著較大的實(shí)用意 義。張雅麗[3]等人對(duì)大豆蛋白芝麻蛋白的合成類(lèi)蛋白質(zhì)研究中指出最佳的底物為水解度為 80%水解物，并非最大的水解度 90%的水解物。劉佳[4]也在大豆蛋白ACE抑制肽的研究中得出：水解度與ACE抑制活性之間存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，水解度的較低和較高都會(huì)降低ACE的抑制活性。彭新顏[5]也指出，并不是水解度越大，所得產(chǎn)物的抗氧化效果越好，而是只有在特定的水解度下，水解物具有最大的抗氧化能力。因此，為了優(yōu)化操作，縮短試驗(yàn)時(shí)間，便于試驗(yàn)條件選擇，需要對(duì)有限水解過(guò)程進(jìn)行模型化研究。

神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Artificial neural networks，ANNs），是一種仿效腦的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)行為特征的數(shù)據(jù)分析方法。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以神經(jīng)元陣列來(lái)模擬生物體學(xué)習(xí)和記憶的方式，通過(guò)改變網(wǎng)絡(luò)的突觸鏈接點(diǎn)的連接關(guān)系對(duì)信息進(jìn)行編碼。ANNs應(yīng)用于一個(gè)實(shí)際問(wèn)題通常需要五個(gè)步驟，在每個(gè)步驟中，研究者必須要選擇適當(dāng)?shù)木W(wǎng)絡(luò)參數(shù)[6,7]。每個(gè)步驟的選擇都基于經(jīng)驗(yàn)以及現(xiàn)存的指導(dǎo)準(zhǔn)則和應(yīng)用實(shí)例。第一步，對(duì)于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和每層的神經(jīng)元數(shù)量的選擇[8,9]。第二步，為隱藏的神經(jīng)元選擇變換算符[6]。第三步是初始分配的權(quán)重。第四步是訓(xùn)練過(guò)程，最常見(jiàn)的訓(xùn)練技術(shù)是反向傳播技術(shù)。最后，是利用未被用于訓(xùn)練的數(shù)據(jù)（測(cè)試集）檢驗(yàn)所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的效果。測(cè)試結(jié)果也可以預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)行過(guò)程和監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的效力[7]。

ANNs的特點(diǎn)不僅可以處理嘈雜、不完整的數(shù)據(jù)和非線性問(wèn)題，也可以在訓(xùn)練過(guò)程之后立即進(jìn)行預(yù)測(cè)和歸納[8]。即使反應(yīng)的機(jī)理不明確這種技術(shù)仍可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)[10,11]；ANNs優(yōu)于其他模型之處還在于可以一邊辨識(shí)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造參數(shù)，一邊學(xué)習(xí)和適應(yīng)樣本。在食品科學(xué)研究中，ANNs用于估計(jì)預(yù)測(cè)食品性質(zhì)和加工中相關(guān)的因素，例如葡萄糖淀粉酶對(duì)淀粉的水解模型，酶失活的動(dòng)力學(xué)模型，利用視覺(jué)技術(shù)及氣味分辨技術(shù)評(píng)價(jià)食品質(zhì)量、品質(zhì)等[12-14]。本實(shí)驗(yàn)的研究目標(biāo)是建立堿性蛋白酶促乳清分離蛋白水解的ANNs預(yù)測(cè)模型。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

Alcalase堿性蛋白酶 丹麥NOVO公司；乳清分離蛋白WPI 美國(guó)HILMAR公司。

PHS-3C型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；磁力加熱攪拌器 杭州儀表電機(jī)廠。

1.2 乳清蛋白的水解

稱取一定量的乳清蛋白，加入蒸餾水中，攪拌均勻，80℃加熱10min，作為儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液在恒溫磁力水浴鍋50℃水浴，加酸(HCl)或堿(NaOH)達(dá)到預(yù)定的pH值，加入試驗(yàn)設(shè)計(jì)量的 Alcalase酶進(jìn)行水解，水解時(shí)間為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間。水解過(guò)程保持不斷地?cái)嚢?，加入NaOH以維持pH值的變化在規(guī)定范圍的±0.05內(nèi)，達(dá)到預(yù)定時(shí)間后，加入2mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH值至4.0，使未水解的蛋白沉淀下來(lái)，100℃水浴15min對(duì)酶進(jìn)行滅活，然后迅速冷卻至室溫，置于離心機(jī)中，以4000r·min-1離心20min，分離出上清液[15]。

1.3 水解度的測(cè)定

水解過(guò)程中通過(guò)從滴定管中連續(xù)的添加少量1mol·L-1NaOH保持pH為試驗(yàn)設(shè)定值。添加量如下：第一次是水解5min后，隨后在120min內(nèi)每次間隔10min，120min后每次間隔20min。水解度計(jì)算公式為[16]:

式中，B為NaOH用量（mL）；

NB是NaOH的標(biāo)定濃度（mol·L-1）；

α是α-氨基基團(tuán)的平均離解度；

MP是水解蛋白的質(zhì)量（g）；

htot是蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù).

1.4 正交試驗(yàn)

正交表L25(56)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，取四個(gè)主要因素pH值、酶用量、底物濃度、水解時(shí)間，每個(gè)因素設(shè)為五個(gè)水平，設(shè)一個(gè)誤差列考察試驗(yàn)誤差，列出影響因素與水平表1，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次。用Excel對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 L25(56)的影響因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬

在正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)正交試驗(yàn)所得到的的25組數(shù)據(jù)和驗(yàn)證組7組數(shù)據(jù)，總計(jì)32組數(shù)據(jù)，使用Matlab的nnet工具包中的nftool建一個(gè)神經(jīng)模型。實(shí)驗(yàn)相關(guān)參數(shù)設(shè)定如下：一般屬性為 4個(gè)， 分別是乳清蛋白水解的pH值、酶用量、底物濃度、水解時(shí)間, 目標(biāo)屬性是水解度(DH/%)；將數(shù)據(jù)集隨機(jī)的分為三組：訓(xùn)練集、測(cè)試集和驗(yàn)證集（80%，10%，10%）；在訓(xùn)練過(guò)程中設(shè)定隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)為15。由于nftool包的初始值為隨機(jī)值，因此每次擬合的效果有一定的隨機(jī)性，因此需要多擬合幾次，從中選擇效果較好的擬合曲線作為訓(xùn)練出的網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解度的正交結(jié)果

根據(jù)表 1 的因素和水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，按照設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得各因素水平組合下的水解度（DH），結(jié)果見(jiàn)表 2，結(jié)果進(jìn)行3 次重復(fù)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

2.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)及參數(shù)選擇

預(yù)測(cè)乳清蛋白水解過(guò)程，采用擬動(dòng)力神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。為了提高網(wǎng)絡(luò)模型性能，選用兩步反向結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)被用于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史了。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了15個(gè)隱藏神經(jīng)元，選用Levenberg-Marquardt訓(xùn)練算法（8個(gè)訓(xùn)練元；訓(xùn)練過(guò)程從隨機(jī)初始權(quán)重值開(kāi)始，并被重復(fù) 100次，以獲得最佳的解決方案）[17]，采用隨機(jī)分配的權(quán)重值，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中包含32個(gè)數(shù)據(jù)用于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型訓(xùn)練。

圖1 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的通用結(jié)構(gòu)Fig.1 The general structure of applied neural model

2.3 乳清蛋白水解神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合結(jié)果分析

誤差直方圖如圖2所示，縱坐標(biāo)代表樣本點(diǎn)個(gè)數(shù)，橫坐標(biāo)代表誤差區(qū)間。各樣本點(diǎn)與零誤差線之間差距代表樣本點(diǎn)與預(yù)測(cè)值之間的誤差?？梢?jiàn)絕大多數(shù)樣本點(diǎn)分布在零誤差線的區(qū)間內(nèi)。而由測(cè)試集的分布可知，首先，測(cè)試集樣本點(diǎn)在零誤差線左右都有分布，說(shuō)明誤差分布均勻；再次，測(cè)試集有四個(gè)點(diǎn)分布在（±1.000）的范圍內(nèi)。說(shuō)明測(cè)試集中的樣本點(diǎn)與預(yù)測(cè)所得輸出值之間誤差較小，說(shuō)明預(yù)測(cè)效果良好，數(shù)據(jù)基本分布在擬合的曲線附近。

圖2 誤差分布直方圖Fig.2 Error Histogram

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練乳清蛋白水解模型其擬合回歸系數(shù)R-value，表現(xiàn)輸出數(shù)據(jù)與目標(biāo)數(shù)據(jù)之間的相關(guān)狀況。圖3可知，Training、Test與All圖中R-value分別為0.98536、0.96239和0.97995，圖中實(shí)線為擬合效果曲線，與R-value =1的標(biāo)準(zhǔn)曲線基本吻合，斜率接近45°，測(cè)試點(diǎn)和樣品點(diǎn)均勻的分布在擬合曲線附近，因此說(shuō)明此模型具有較好的訓(xùn)練效果、預(yù)測(cè)能力和整體擬合效果。Validation圖中R=1，說(shuō)明當(dāng)前設(shè)置的參數(shù)下，擬合結(jié)果隨機(jī)驗(yàn)證效果優(yōu)良。對(duì)于訓(xùn)練數(shù)據(jù)，不僅相關(guān)系數(shù)據(jù)在0.9600～0.9999范圍內(nèi)，而且該模型是在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上得到的，總是包含噪聲，例如測(cè)量誤差等。因此我們可以認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)所建立的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的水解模型能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3 擬合回歸及驗(yàn)證測(cè)試圖Fig.3 Plotregression and verification figure

2.4 預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)比

訓(xùn)練好的網(wǎng)絡(luò)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證可以判定其效果，5組數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)比表Table 3 Comparison of prediction results to target

由表3可得，輸入的5組測(cè)試樣品與網(wǎng)絡(luò)輸出值之間的最大誤差不超過(guò)3%，說(shuō)明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型具有較高的預(yù)測(cè)能力和精度，模型可用于對(duì)水解程度的預(yù)測(cè)，對(duì)堿性蛋白酶有限水解乳清蛋白具有指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在正交試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，選用3層人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置了15個(gè)隱藏神經(jīng)元，選用ANN神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法建立了水解模型，迭代計(jì)算后最終整體R-value=0.97995，結(jié)果表明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合效果很好，而對(duì)于測(cè)試集合的 R-value=0.96239，表明該水解模型有很好的預(yù)測(cè)能力，能夠完成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測(cè)。選用的測(cè)試組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸出值之間的誤差均在±3%以內(nèi)，說(shuō)明其具有良好的預(yù)測(cè)能力。從以上結(jié)果可知，在有限水解范圍內(nèi)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)模型能夠很好的預(yù)測(cè)水解程度，可以用此模型進(jìn)一步研究的蛋白功能特性和多肽的生理生物活性物質(zhì)，并且更利于水解條件的選擇，還可以縮短必要的工藝時(shí)間。

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