杜文佳，汪玉良，黨躍修，雷栓虎，黃良增，汪靜，馬靖琳，安麗萍

細(xì)胞松弛素D對(duì)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白和內(nèi)向整流性鉀通道4.1基因表達(dá)的影響①

杜文佳，汪玉良，黨躍修，雷栓虎，黃良增，汪靜，馬靖琳，安麗萍

目的探討不同濃度細(xì)胞松弛素D(CytD)對(duì)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架重構(gòu)，水通道蛋白(AQP)1、AQP4及內(nèi)向整流性鉀通道4.1(Kir4.1)基因表達(dá)的影響。方法原代培養(yǎng)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，加CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40 μg/ml、0.80 μg/ml和1.00 μg/ml共培養(yǎng)2 h、12 h和24 h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；鬼筆環(huán)肽聯(lián)合Hoechst 33342套染后激光共聚焦顯微鏡下觀察共培養(yǎng)2 h后細(xì)胞骨架重構(gòu)情況；RT-PCR法檢測(cè)共培養(yǎng)2 h時(shí)AQP1、AQP4和Kir4.1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果細(xì)胞生存率隨CytD濃度升高和作用時(shí)間延長(zhǎng)而減少。CytD使大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞微絲發(fā)生解聚、彎曲，但極性未失。CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml和0.40 μg/ml上調(diào)AQP1、AQP4和Kir4.1 mRNA表達(dá)。結(jié)論適當(dāng)濃度CytD可以重建星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架，上調(diào)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP1、AQP4和Kir4.1基因表達(dá)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞松弛素；細(xì)胞骨架；水通道蛋白；內(nèi)向整流性鉀通道；脊髓；大鼠

[本文著錄格式] 杜文佳，汪玉良，黨躍修，等.細(xì)胞松弛素D對(duì)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白和內(nèi)向整流性鉀通道4.1基因表達(dá)的影響基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20(7):616-620.

星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有免疫調(diào)節(jié)、維持神經(jīng)元微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定和調(diào)節(jié)突觸信號(hào)傳遞等作用[1-4]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)生水腫，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重構(gòu)，進(jìn)而影響細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸、基因表達(dá)和信號(hào)傳遞等生命過(guò)程。水通道蛋白(aquaporin,AQPs)是星形膠質(zhì)細(xì)胞中一組參與跨細(xì)胞水轉(zhuǎn)運(yùn)的膜通道蛋白，它們不僅在維持顱內(nèi)滲透壓及水電解質(zhì)平衡中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也參與腦缺血、腦腫瘤和顱內(nèi)感染等誘發(fā)的腦水腫病理過(guò)程。本研究采用細(xì)胞松弛素D(cytochalasin D,CytD)對(duì)體外培養(yǎng)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞重構(gòu)其細(xì)胞骨架系統(tǒng)，研究不同濃度CytD作用下，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、微絲系統(tǒng)的改變及AQP1、AQP4和內(nèi)向整流性鉀通道4.1(inward rectifying potassium channel 4.1,Kir4.1)基因表達(dá)的變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)新生2～3 d Sprague-Dawley大鼠，由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK甘2004-0006-152)。

1.2 主要儀器與試劑

DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和胰蛋白酶：GIBCO公司。青霉素、鏈霉素：華北制藥股份有限公司。阿糖胞苷：上海華聯(lián)制藥有限公司。CytD、多聚賴(lài)氨酸和Triton X-100：SIGMA公司。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)兔多克隆抗體：PROTEINTECH GROUP公司。羊抗兔IgG-FITC：北京中杉公司。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒：INVITROGEN公司。激光共聚焦顯微鏡：OLYMPUS公司。實(shí)時(shí)定量PCR儀：BIORAD公司。二氧化碳培養(yǎng)箱：SANYO公司。

1.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

新生Sprague-Dawley大鼠10只，75%酒精浸泡5 min后移至超凈工作臺(tái)，無(wú)菌條件下分離脊髓組織；DMEM培養(yǎng)液清洗1次，加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化15 min，完全培養(yǎng)液終止消化。反復(fù)吹打后，1500 r/min離心10 min，棄上清。200目篩網(wǎng)過(guò)濾后加入DMEM-F12培養(yǎng)基(含10%FBS)，加入完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，將其接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，差速貼壁。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)48 h后換液。以后每隔3 d換液1次，待細(xì)胞融合成單層并鋪滿(mǎn)瓶底后，傳代培養(yǎng)。

1.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

取P2代細(xì)胞，以每孔3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)12 h。棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加預(yù)冷甲醛200 μl，37℃固定20 min；PBS清洗3次，加入PBS-T 200 μl，4℃10 min后移除PBS-T，PBS清洗5 min；加入PBS-B 200 μl，37℃30 min。加入GFAP一抗100 μl，4℃過(guò)夜，PBS清洗5 min；加羊抗兔FITC標(biāo)記二抗150 μl，37℃ 1 h；PBS洗3次，每次5 min。封片，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照，熒光顯微鏡下檢測(cè)GFAP表達(dá)并拍照。

1.5 MTT檢測(cè)

P2代星形膠質(zhì)細(xì)胞以3×103/ml接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，分別換入含CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40 μg/ml、0.80 μg/ml、1.00 μg/ml完全培養(yǎng)液，空白對(duì)照組正常換液。培養(yǎng)2 h、12 h和24 h后棄去上清液，每孔加入無(wú)血清DMEM/ F12培養(yǎng)液100μl、0.5%MTT 10μl、DMSO 100μl，振蕩10 min，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(OD)。

1.6 激光共聚焦顯微觀察

P2代星形膠質(zhì)細(xì)胞以每孔5×105接種于24孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞爬片，分別換含CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40 μg/ml、0.8 μg/ml的完全培養(yǎng)基，空白對(duì)照孔正常換液。繼續(xù)培養(yǎng)2 h后棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，每孔加入4%多聚甲醛1 ml，室溫固定20 min。10 μg/ml鬼筆環(huán)肽37℃染色1 h，PBS洗3次，每次5 min；加入10 μg/ml Hoechst 33342室溫染色15 min，PBS洗3次。抗熒光淬滅封片劑封片，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，激光共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。

1.7 RT-PCR

按照Trizol說(shuō)明書(shū)提取空白對(duì)照組以及各濃度CytD培養(yǎng)2 h后星形膠質(zhì)細(xì)胞總RNA，A260、A280檢測(cè)提取純度及濃度，1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。取1 μg總RNA為模板，以寡核苷酸(Oligo dT)為引物，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，所得cDNA-20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后，用RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增與定量反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1，反應(yīng)體系50 μl，擴(kuò)增條件為50℃ 2 min，95℃預(yù)變性2 min后，95℃ 15 s、61.2℃ 35 s，共45個(gè)循環(huán)，每次延伸結(jié)束后讀板，采用2-ΔΔCt法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行定量分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列表

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

P2細(xì)胞GFAP陽(yáng)性率＞95%。倒置相差顯微鏡觀察：GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞體較大，有短而粗大的突起，形態(tài)不規(guī)則，輪廓較清晰(圖1)。

2.2 MTT

培養(yǎng)2 h后，與空白對(duì)照組比較，CytD各濃度組細(xì)胞的存活率均有所下降，且0.80 μg/ml和1.00 μg/ml組有顯著性差異(P＜0.05)；培養(yǎng)12 h、24 h后，CytD各濃度組細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降，與空白對(duì)照組均存在顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 細(xì)胞骨架

倒置相差顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組細(xì)胞胞體較大，呈星形或多角形，胞突較多較長(zhǎng)，胞核圓形或橢圓形，常偏于胞體一側(cè)。CytD各濃度組細(xì)胞體積增大，形狀不規(guī)則，胞突數(shù)量增多，細(xì)胞間緊密連接變少，胞核區(qū)域不明顯。見(jiàn)圖2。

激光共聚焦顯微觀察，空白對(duì)照組細(xì)胞微絲骨架排布呈明顯極性，分布均勻，微絲筆直；Cyt D可使星形膠質(zhì)細(xì)胞微絲骨架發(fā)生解聚并彎曲，呈片狀，但未喪失排布極性。見(jiàn)圖3。

2.4 RT-PCR

與空白對(duì)照組比較，Cyt D 0.05 μg/ml、0.10 μg/ ml、0.20 μg/ml和0.40 μg/ml濃度組AQP1表達(dá)量上調(diào)(P＜0.05)，各濃度組間比較也均有顯著性差異(P＜0.05)；AQP4表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，各濃度組間比較也均有顯著性差異(P＜0.05)；Kir4.1表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，各濃度組間比較也均有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組細(xì)胞生存率比較

表3 各組細(xì)胞AQP1、AQP4和Kir4.1表達(dá)比較

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定(100×)

圖2 各組細(xì)胞培養(yǎng)2 h形態(tài)(倒置相差顯微鏡，400×)

圖3 各組細(xì)胞培養(yǎng)2 h形態(tài)(激光共聚焦顯微鏡，400×)

3 討論

細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中的蛋白網(wǎng)架系統(tǒng)[7]。廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞核骨架、細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架和細(xì)胞外基質(zhì)，形成貫穿于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的網(wǎng)架體系[8]；通常所稱(chēng)的狹義細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)骨架，由微絲、微管和中間纖維構(gòu)成[9]。細(xì)胞骨架能維持細(xì)胞的正常形態(tài)，但并非靜止的支架系統(tǒng)，而是一個(gè)組裝與去組裝動(dòng)態(tài)平衡的網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)揮著多種生物學(xué)功能[10]。

CytD是公認(rèn)的能夠破壞細(xì)胞微絲的藥物[11]。我們采用CytD對(duì)大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的微絲系統(tǒng)進(jìn)行干預(yù)。我們的研究證實(shí)，CytD對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞體外增殖有一定抑制作用，但0.05～0.40 μg/ml濃度共培養(yǎng)2 h，細(xì)胞生存率＞90%，與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異。

相差顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡觀察，CytD可使星形膠質(zhì)細(xì)胞體積增大，偽足增長(zhǎng)，胞突數(shù)量增多，細(xì)胞間緊密連接喪失；細(xì)胞骨架解聚。已有研究報(bào)道，星形膠質(zhì)細(xì)胞緊密連接的破壞，可能與臨床腦外傷后血腦屏障破壞產(chǎn)生廣泛的腦水腫有關(guān)[12]。我們推測(cè)，星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫可能與細(xì)胞骨架解聚存在著一定關(guān)系。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布著幾種AQPs，其中研究較多的有AQP1、AQP4和AQP9。有研究顯示，AQP1和AQP4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的AQPs，與腦脊液的形成存在密切聯(lián)系；由于分布位置的特殊性，AQP4在腦水腫顱內(nèi)水平衡調(diào)節(jié)上可能發(fā)揮著重要作用[13-15]。

AQP1和AQP4與脊髓損傷后水腫的形成也關(guān)系密切。有研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上AQP4和Kir4.1在某些膠質(zhì)細(xì)胞特殊膜域有密切的共同表達(dá)，推測(cè)AQP4介導(dǎo)的水分子轉(zhuǎn)運(yùn)可能與Kir4.1調(diào)節(jié)K+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用相偶聯(lián)[16-17]。關(guān)于細(xì)胞骨架與膜蛋白之間的關(guān)系，目前研究較多的是細(xì)胞骨架與心肌快鈉內(nèi)流(INa)的關(guān)系。已有研究表明，細(xì)胞骨架的重構(gòu)與心肌細(xì)胞膜蛋白功能存在密切聯(lián)系[18]。星形膠質(zhì)細(xì)胞與細(xì)胞骨架之間的關(guān)系鮮有報(bào)道。

本研究中RT-PCR結(jié)果顯示，CytD可以上調(diào)AQP1、AQP 4和Kir4.1 mRNA的表達(dá)水平，推測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架對(duì)與水腫相關(guān)的離子通道及膜蛋白具有調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞骨架解聚可能導(dǎo)致細(xì)胞水腫發(fā)生。

本文通過(guò)CytD重構(gòu)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架，應(yīng)用形態(tài)學(xué)及RT-PCR等方法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道蛋白以及K+通道基因表達(dá)水平。結(jié)果提示，應(yīng)用CytD后，星形膠質(zhì)細(xì)胞骨架發(fā)生解聚，AQPs、Kir4.1表達(dá)水平上調(diào)；不同濃度CytD對(duì)AQPs、Kir4.1表達(dá)的調(diào)控可在2 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)，并存在量效關(guān)系。我們推測(cè)，微絲解聚可能會(huì)引起細(xì)胞水腫，其機(jī)制可能與上調(diào)水腫相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。這些為臨床治療脊髓損傷、脊髓水腫提供了基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)資料。

為了進(jìn)一步研究細(xì)胞骨架解聚與細(xì)胞水腫的關(guān)系，還需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

[1]Nag S.Morphology and properties of astrocytes[J].Methods Mol Biol,2011,686:69-100.

[2]Figley CR,Stroman PW.The role(s)of astrocytes and astrocyte activity in neurometabolism,neurovascular coupling,and the production of functional neuroimaging signals[J].Eur J Neurosci,2011,33(4):577-588.

[3]Barker AJ,Ullian EM.Astrocytes and synaptic plasticity[J]. Neuroscientist,2010,16(1):40-50.

[4]魏開(kāi)斌,卓鋒,劉紅,等.靜脈移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性脊髓損傷[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2012,29(12):2579.

[5]Wang F,Feng XC,Li YM,et al.Aquaporins as potential drug targets[J].Acta harmacol Sin,2006,27(4):395-401.

[6]Janmey PA.The cytoskeleton and cell signaling:componentlocalization and mechanical coupling[J].Physiol Rev,1998,78 (3):763-781.

[7]Ochi M.Clinical results of transplantation of tissue-engineered cartilage and future direction of cartilage rep air-novel approach with minimally invasive procedure[J].Yonsei Med J, 2004,45(12):45-74.

[8]Redman SN,Oldfield SF,Archer CW,et al.Current strategies for articular cartilage repair[J].Eur Cell Mater,2005,14(9): 23-32.

[9]Buckwalter JA,Mow VC,Ratliff A.Restoration of injured or degenerated articular surfaces[J].J Am Acad Orthop Surg, 1994,2(4):192-201.

[10]Iwata H.Pharmacologic and clinical aspects of intra articular injection of hyaluronate[J].Clin Orthop Relat Res,1993,289 (4):285-291.

[11]王彥明,余家闊,于長(zhǎng)隆,等.Pridie鉆孔術(shù)修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損的臨床療效觀察[J].中國(guó)微創(chuàng)外科雜志,2006,6(11): 8612-8631.

[12]王克萬(wàn),漆松濤,楊志煥,等.培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞牽張損傷后超微結(jié)構(gòu)的變化[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,22(8): 687-696.

[13]McConnell NA,Yunus RS,Gross SA,et al.Water permeability of an ovarian antral follicle is predominantly transcellular and mediated by aquaporins[J].Endocrinology,2002,143(8): 2905-2912.

[14]Gohara T,Ishida K,Nakakimura K,et al.Temporal profiles of aquaporin 4 expression and astrocyte response in the process of brain damage in fat embolism model in rats[J].J Anesth,2010, 24(2):225-233.

[15]Zeng HK,Wang QS,Deng YY,et al.Hypertonic saline ameliorates cerebral edema through downregulation of aquaporin-4 expression in the astrocytes[J].Neuroscience,2010,166(3): 878-885.

[16]Nagelhus EA,Horio Y,Inanobe A,et al.Irnrnunogold evidence suggests that coupling of K+siphoning and water transport in rat retinal Muller cells is mediated by a coenrichment of Kir4.1 and AQP4 in specific membrane domains[J].Glia, 1999,26(1):47-54.

[17]Nagelhus EA,Mathilsen TM,Ottersen OP.Aquaporin-4 in the central nervous system:cellular and subcellular distribution and coexpression with Kir4.1[J].Neuroseience,2004,129(4): 905-913.

[18]Berdiev BK,Prat AG,Cantiello HF,et al.Regulation of epithelial sodium channels by short actin filaments[J].Biol Chem,1997,271(30):17704-17710.

Effects of Cytochalasin D on Expression of Aquaporins and Inward Rectifying Potassium Channel 4.1 Gene in Spinal Cord Astrocytes of Rats

DU Wen-jia,WANG Yu-liang,DANG Yue-xiu,et al.Department of Orthopedics,The Second Hospital of Lanzhou University, Orthopaedics Key Laboratory of Gansu Province,Lanzhou,Gansu 730030,China

ObjectiveTo investigate the expression of aquaporin(AQP)1,AQP4,inward rectifying potassium channel 4.1(Kir4.1)and cytoskeleton features of rat spinal cord astrocytes after cytochalasin D(CytD)intervention.MethodsSpinal cord astrocytes isolated from 2～3-day-old rats were cultured till confluency.MTT was used to assess survival rate of astrocytes 2 h,12 h and 24 h after co-cultured with 0.05 μg/ml,0.10 μg/ml,0.20 μg/ml,0.40 μg/ml,0.80 μg/ml and 1.00 μg/ml of CytD,respectively.Confocal microscopy was used to observe cytoskeleton features of astrocytes 2 h after co-cultured with 0.05 μg/ml,0.10 μg/ml,0.20 μg/ml,0.40 μg/ml of CytD.The expression of AQP1, AQP4,Kir4.1 mRNA were determined with real-time PCR 2 h after co-cultured with 0.05 μg/ml,0.10 μg/ml,0.20 μg/ml,0.40 μg/ml,0.80 μg/ml and 1.00 μg/ml of CytD.ResultsThe survival rate of rat spinal cord astrocytes reduced with the time of co-culture and concentration of CytD(P＜0.05).The cytoskeleton of astrocytes was reconstructed.The expression of AQP1,AQP4 and Kir4.1 mRNA increased after co-cultured with 0.05～0.40 μg/ml of CytD.ConclusionThe appropriate dosage of CytD may remodel the cytoskeleton and increase the mRNAexpression ofAQP1,AQP4 and Kir4.1 in spinal cord astrocytes of rats.

astrocyte;cytochalasin;cytoskeleton;aquaporin;inward rectifying potassium channel;spinal cord;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.07.003

R651.2

A

1006-9771(2014)07-0616-05

2013-10-22

2013-11-27)

1.甘肅省技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目(No.1004TCYA028)；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院2010年度院內(nèi)科研項(xiàng)目(No.YJ2010-48)。

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州市730030；2.甘肅省骨關(guān)節(jié)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州市730030。作者簡(jiǎn)介：杜文佳(1980-)，男，甘肅山丹縣人，碩士研究生，主要研究方向：脊髓損傷與骨腫瘤。通訊作者：汪玉良，男，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。