王永宏+趙晨曦+陳本美+賀敏+劉琳琪+李春艷+陳新

[摘要] 目的：探討茵陳蒿湯抗二甲基亞硝胺（DMN）誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化作用。方法：采用1%DMN按照1 mL給予大鼠腹腔注射制備肝纖維化模型，每周前3 d每天1次，連續(xù)造模3周；造模當(dāng)天開始灌胃給藥水飛薊素（陽性對(duì)照組，50 mg·kg^-1·d^-1）、茵陳蒿湯（高、中、低劑量治療組，20.0，8.0，3.2 g·kg^-1·d^-1），模型組和正常對(duì)照組大鼠灌胃生理鹽水，連續(xù)干預(yù)5周；采用HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化；測(cè)定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST） 、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-GGT）、透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅳ型膠原（CⅣ）和Ⅲ型前膠原氨端肽（PⅢNP）水平；測(cè)定肝組織氨基酸代謝譜及羥脯氨酸含量。結(jié)果：與模型組比較，茵陳蒿湯高、中劑量能顯著逆轉(zhuǎn)大鼠肝組織病理學(xué)變化；茵陳蒿湯能劑量依賴性降低大鼠血清中ALT，AST，γ-GGT，HA，LN，CⅣ及PⅢNP水平；茵陳蒿湯能劑量依賴性降低肝組織羥脯氨酸含量，并能改變大鼠肝組織中氨基酸代謝譜。結(jié)論：茵陳蒿湯具有明顯逆轉(zhuǎn)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)所致大鼠肝纖維化的作用。

[關(guān)鍵詞] 茵陳蒿湯； 肝纖維化； 二甲基亞硝胺； 羥脯氨酸

[收稿日期] 2013-08-13

[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173533）；湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（11A017）；長沙市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（K110703-11）

[通信作者] 趙晨曦，Tel：（0731）84261424，E-mail： cxzh003@163.com

[作者簡介] 王永宏，教授，Tel：（0731）84261277，E-mail： 13873107052@163.com

肝纖維化（hepatic fibrosis）是諸多慢性肝病所共同的病理特征，其包括肝內(nèi)纖維生成與降解失衡、肝內(nèi)過多膠原沉積、肝纖維結(jié)締組織異常增生等。逆轉(zhuǎn)肝纖維化是防治肝硬化和肝癌的有效途徑，但由于其形成與發(fā)展過程頗為復(fù)雜，這使得目前尚無特效的化學(xué)藥或生物藥對(duì)肝纖維化進(jìn)行有效治療[1]。近年來中藥復(fù)方在干預(yù)肝纖維化方面已顯示越來越明顯的優(yōu)勢(shì)，據(jù)國內(nèi)外臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，扶正化瘀319方、復(fù)方861合劑、復(fù)方鱉甲軟肝片等中藥復(fù)方均具有顯著的抗肝纖維化治療作用[2-4]。茵陳蒿湯出自漢代張仲景的《傷寒論》，由茵陳、梔子和大黃組成，具有清熱利濕、利膽退黃的功效，是臨床上治療各種肝病的重要方劑[5-7]。本文擬采用DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，探討茵陳蒿湯抗實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用，為其臨床用藥及該類新藥開發(fā)提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 水飛薊素膠囊（利加隆，Legalon，德國馬博士大藥廠，批號(hào)81002184）。茵陳蒿湯：藥材一次性購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中藥房，依據(jù)《傷寒論》按照茵陳蒿18 g、生梔子9 g和大黃6 g的比例，取3.6 kg茵陳蒿（產(chǎn)地河北，批號(hào)111102）、1.8 kg生梔子（產(chǎn)地江西，批號(hào)1112009）和1.2 kg大黃（產(chǎn)地甘肅，批號(hào)2011090810）委托湖南中醫(yī)藥大學(xué)湖南中醫(yī)藥研究院中藥研究所制備茵陳蒿湯干粉。先將茵陳蒿加10倍量水，浸泡1 h，煎煮30 min，再加入搗碎的生梔子和大黃煎煮15 min，過濾后取濾液。藥渣再加入8倍量的水煎煮20 min，過濾，合并2次濾液，濃縮成浸膏，干燥后得1.2 kg干粉，避光冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 二甲基亞硝胺（DMN，美國Sigma公司產(chǎn)品，1 g·mL^-1）由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院友好提供；羥脯氨酸（Hyp）等17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司（批號(hào)48H9800）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號(hào)25120746）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，批號(hào)25120786）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)酞酶（γ-GGT，批號(hào)25120784）檢測(cè)試劑盒購自桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子集團(tuán)公司；透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅳ型膠原（CⅣ）和Ⅲ型前膠原氨端肽（PⅢNP）放免試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所（批號(hào)120720）；9-芴基甲氧基碳酰氯（Sigma公司，批號(hào)48H3771，F(xiàn)MOC，AR）；硼酸（長沙湘科精細(xì)化工廠，AR，批號(hào)20090705）。

1.3 儀器 LC-2010AHT型HPLC（四元梯度泵，紫外檢測(cè)器，Labsolution色譜工作站，島津，日本）；D1810C型電子分析天平（上海申生科技有限公司）；5430R型高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；URIT-8000型全自動(dòng)生化分析儀（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子集團(tuán)公司）；GC-300型γ-放射免疫計(jì)數(shù)器（中國科大中佳公司）。

1.4 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠96只，體重（200±20） g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2009-0004，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（湘）2010-0008。

2 方法

2.1 分組 設(shè)正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照水飛薊素組（50 mg · kg^-1）、茵陳蒿湯高、中、低劑量組（湯劑干粉3.125，1.25，0.50 g·kg^-1·d^-1，折算生藥20.0，8.0，3.2 g·kg^-1·d^-1），共6組，其中模型組大鼠21只，其他各組為15只。

2.2 造模及給藥 以無菌生理鹽水配制1%的DMN溶液，實(shí)驗(yàn)大鼠稱重后按照1 mL·kg^-1劑量腹腔注射DMN，對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，每周前3 d每日造模1次，第3周末處死大鼠并觀察其纖維化形成情況，依據(jù)造模程度以確定是否需繼續(xù)注射DMN。大鼠每周稱體重1次，并按體重增長而相應(yīng)增加藥物劑量。給藥組大鼠（水飛薊素、茵陳蒿湯高、中、低劑量）自第1次注射DMN便開始按照10 mL·kg^-1體積灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物，對(duì)照組和模型組大鼠則灌胃給予等體積的生理鹽水，每天1次，共5周。大鼠每周稱體重1次，并按體重增長而相應(yīng)增加藥物劑量。endprint

2.3 樣品采集 給藥第5周末腹腔注射5%異戊巴比妥麻醉大鼠，于腹腔靜脈取血，收集血液，離心分離出血清，留取部分血清用于血清指標(biāo)測(cè)定，其余血清于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫蝗「谓M織左葉下段組織（10 mm×10 mm×10 mm），用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下作病理學(xué)檢查，肝纖維化分級(jí)采用Scheuer法。分裝余下肝組織，迅速放入液氮中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 肝組織前處理及HPLC分析條件 參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[8]，經(jīng)適當(dāng)?shù)馗倪M(jìn)后建立了如下的肝組織消化處理方法，取冷凍的肝臟樣本0.150 0～0.200 0 g，置于水解玻璃瓶中，加入6 mol·L^-1的HCl 10 mL，然后用酒精噴燈燒結(jié)瓶口，再放入烘箱中，于110 ℃溫度下持續(xù)24 h進(jìn)行消化處理，待樣本冷卻后，用鑷子敲碎水解玻璃瓶，將沉淀搖勻并取其中的100 μL放入2 mL塑料錐形管中，然后于15 000 r·min^-1離心5 min，取上清液10 μL放入錐形塑料瓶中，氮?dú)獯蹈?，然后?0 μL蒸餾水溶解。

柱前衍生：溶解以后的樣品用10 μL的9-芴基甲氧基碳酰氯（FMOC）和20 μL硼酸進(jìn)行衍生并在35 ℃的溫度下恒溫衍生10 min[9]，然后用500 μL乙醚萃取，移去上層乙醚液，用下層液立即進(jìn)行HPLC分析。XDB-C₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，2.0 μm，安捷倫）；流動(dòng)相A（5%乙腈，95%醋酸鈉）及B（95%乙腈，5%醋酸鈉），流速1.0 mL·min^-1；進(jìn)樣體積20 μL；柱溫35 ℃；紫外波長檢測(cè)器：檢測(cè)波長265 nm。在以上色譜基本條件下對(duì)梯度洗提程序進(jìn)行優(yōu)化，得到的梯度洗提程序?yàn)?～10 min，23%～29%A；10～15 min，29%～38%A；15～20 min，38%～55%A；20～25 min，55%～75%A；25～27 min，75%～92%A；27～30 min，92%A；30～32 min，92%～23%A。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

第5周末處死大鼠，對(duì)照組沒有大鼠死亡，解剖7只；模型組在第3周末解剖3只觀察發(fā)現(xiàn)纖維化已經(jīng)形成，死亡4只；水飛薊素組死亡5只；茵陳蒿湯高劑量組死亡3只，中劑量組死亡7只，低劑量組死亡3只。

3.1 大鼠肝組織病理學(xué) 對(duì)照組（圖1中A） 肝細(xì)胞正常，未見明顯纖維化，為肝纖維化S0級(jí)；模型組（圖1中B）肝細(xì)胞纖維化程度明顯，表現(xiàn)為肝纖維化S4級(jí)；水飛薊素組（圖1中C）和茵陳蒿湯高劑量組（圖1中D）有輕度纖維化（匯管區(qū)有輕微纖維化及少量炎癥細(xì)胞浸潤），表現(xiàn)為肝纖維化S1級(jí)；茵陳蒿湯中劑量組（圖1中E）有輕微纖維化（為匯管區(qū)周圍纖維化或纖維隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留），表現(xiàn)為肝纖維化S2級(jí)；茵陳蒿湯低劑量組（圖1中F）有明顯纖維化（匯管區(qū)有較明顯纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤），表現(xiàn)為肝纖維化S3。上述結(jié)果提示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝細(xì)胞纖維化程度明顯，表明造模成功；與模型組比較，茵陳蒿湯高劑量組、中劑量組均能顯著逆轉(zhuǎn)大鼠肝纖維化，且高劑量組與陽性藥水飛薊素效果相當(dāng)，但茵陳蒿湯低劑量組未能減輕大鼠肝纖維化程度。

3.2 大鼠血清學(xué)指標(biāo) 肝功能指標(biāo)：與對(duì)照組比較，模型組肝功能指標(biāo)均明顯升高，表明造模成功；與模型組比較，水飛薊素組和茵陳蒿湯高劑量組血清中ALT水平顯著降低（P<0.05），而中劑量組和低劑量組ALT水平降低不明顯；與模型組比較，水飛薊素、茵陳蒿湯高、中劑量組血清中AST水平顯著降低（P<0.05），而低劑量組ALT水平降低不明顯；與模型組比較，僅有茵陳蒿湯高劑量組大鼠血清中γ-GGT水平顯著降低（P<0.05），而其他各組γ-GGT水平降低均未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示，茵陳蒿湯能劑量依賴性降低大鼠血清中ALT，AST，γ-GGT含量，其中降低AST水平最顯著（表1）。

肝纖維化4項(xiàng)指標(biāo)：與對(duì)照組比較，模型組HA，LN，CⅣ和PⅢNP含量均明顯升高，表明造模成功，同時(shí)提示HA，LN，CⅣ和PⅢNP水平與肝纖維化程度密切相關(guān)；與模型組比較，茵陳蒿湯高、中劑量組和水飛薊素組均能顯著降低大鼠血清肝纖維化4項(xiàng)指標(biāo)含量（P<0.01或P<0.05），而低劑量組各項(xiàng)指標(biāo)含量降低沒有顯著變化。上述結(jié)果提示茵陳蒿湯能劑量依賴性降低大鼠血清中HA，LN，CⅣ和PⅢNP含量，其中降低PⅢNP水平最顯著，各劑量組大鼠血清中PⅢNP含量已接近正常對(duì)照組（表2）。

3.3 大鼠肝組織氨基酸譜及羥脯氨酸含量 氨基酸譜：各組大鼠肝組織經(jīng)消化處理、柱前衍生后，采用高效液相色譜法分離測(cè)定氨基酸，圖示為肝組織中典型的氨基酸譜（圖2），不同處理組氨基酸譜有明顯的差異，這提示茵陳蒿湯干預(yù)后大鼠代謝譜發(fā)生了明顯變化，但其變化規(guī)律有待于進(jìn)一步研究。

羥脯氨酸含量：采用外標(biāo)法定量分析各組大鼠體內(nèi)羥脯氨酸含量，與對(duì)照組比較，模型組羥脯氨酸含量明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，茵陳蒿湯高、中劑量組和水飛薊素組均能顯著降低大鼠肝組織羥脯氨酸含量（P<0.05），而低劑量組降低不明顯，無顯著性差異（表3）。提示茵陳蒿湯能劑量依賴性降低大鼠肝組織羥脯氨酸水平。

4 討論

茵陳蒿湯源自漢張仲景《傷寒論》，由茵陳、梔子和大黃組成，三藥相合，清熱泄?jié)?，疏肝利膽，常用于治療陽明濕熱蘊(yùn)結(jié)的發(fā)黃。近年來國內(nèi)外相關(guān)研究表明茵陳蒿湯具有潛在的抗肝纖維化作用，其對(duì)四氯化碳（CCl₄）[10-11]，DMN，硫代乙酰胺（TAA）[12]以及膽管結(jié)扎[7，13]誘導(dǎo)的肝纖維化動(dòng)物模型均有較好的治療作用，而且劉平課題組發(fā)現(xiàn)DMN誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型與茵陳蒿湯的濕熱內(nèi)蘊(yùn)方證存在高度的相關(guān)性[14-15]，因此本文采用DMN制備肝纖維化模型，經(jīng)造模后發(fā)現(xiàn)模型組大鼠體內(nèi)ALT，AST，γ-GGT，HA，LN，CⅣ和PⅢNP水平均明顯升高，組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明模型組大鼠的肝細(xì)胞纖維化程度明顯，這提示造模成功，而且該模型在病理學(xué)及生化指標(biāo)等方面與人的肝纖維化進(jìn)展相似，可用于探討茵陳蒿湯抗實(shí)驗(yàn)性肝纖維化作用。endprint

ALT，AST和γ-GGT是臨床上常見的肝功能指標(biāo)，它們與肝功能及肝損傷程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明茵陳蒿湯能劑量依賴性降低大鼠血清中ALT，AST和γ-GGT水平，這提示其具有保肝護(hù)肝作用。此外肝組織病理學(xué)HE染色結(jié)果表明茵陳蒿湯能減少炎癥細(xì)胞浸潤和膠原沉積，從而保護(hù)肝細(xì)胞，這進(jìn)一步提示其具有很好的保肝作用。由于肝細(xì)胞損傷是肝纖維化形成的啟動(dòng)因素，因此茵陳蒿湯的保肝作用可能是其抗實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的作用機(jī)制之一。

肝纖維化是發(fā)展為肝硬化及肝癌的必經(jīng)階段，其主要表現(xiàn)為肝結(jié)締組織異常增生、肝竇毛細(xì)血管化、炎癥細(xì)胞浸潤增加、細(xì)胞外間質(zhì)（ECM）合成與分泌增加、調(diào)控ECM分泌的細(xì)胞肝星狀細(xì)胞（HSC）表達(dá)增加等[16]。HA，LN，CⅣ和PⅢNP這4種血清標(biāo)志物與肝纖維化程度密切相關(guān)[17]，相關(guān)研究[18]發(fā)現(xiàn)肝纖維化過程中的ECM成分包括膠原蛋白、非膠原性糖蛋白和蛋白多糖3類，而HA是構(gòu)成ECM中蛋白多糖的主要成分， LN亦是其重要的結(jié)構(gòu)糖蛋白，血清中HA 和LN水平與肝纖維化程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明茵陳蒿湯能劑量依賴性降低大鼠血清中HA，LN，CⅣ和PⅢNP含量，這提示其能明顯減少膠原纖維的合成與沉積，從而逆轉(zhuǎn)大鼠肝纖維化，故抑制肝組織內(nèi)HA，LN，CⅣ和PⅢNP水平增高很可能是茵陳蒿湯抗實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的主要作用機(jī)制。

本研究還發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯高、中劑量組均能顯著降低大鼠肝組織內(nèi)羥脯氨酸含量，由于膠原纖維主要由膠原蛋白構(gòu)成，而羥脯氨酸常被認(rèn)為是膠原蛋白的特有成分，肝組織羥脯氨酸含量可間接反映肝纖維化的程度，因此抑制羥脯氨酸含量亦可能是茵陳蒿湯抗肝纖維化作用的潛在作用機(jī)制之一。 此外茵陳蒿湯還能改變大鼠肝組織內(nèi)的氨基酸代謝譜，但具體的作用機(jī)制及變化規(guī)律仍有待進(jìn)一步研究?？傊?，本文結(jié)果提示茵陳蒿湯具有明顯逆轉(zhuǎn)二甲基亞硝胺誘導(dǎo)所致大鼠肝纖維化的作用。

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Reverse effect of Yinchenhao decoction in dimethyl

nitrosamine-induced hepatic fibrosis in rats

WANG Yong-hong， ZHAO Chen-xi， CHEN Ben-mei， HE Min， LIU Lin-qi， LI Chun-yan， CHEN Xin

（1.Department of Bioengineering and Environmental Science， Changsha University， Changsha 410022， China；

2.Modern Analysis and Testing Center， Central South University， Changsha 410008， China；

3.Department of Pharmaceutical Engineering， School of Chemical Engineering， Xiangtan University， Xiangtan 411105， China）

[Abstract] Objective： To discuss the reverse effect of Yinchenhao decoction（YCHD） in dimethyl nitrosamine（DMN）-induced hepatic fibrosis in rats. Method： The rat hepatic fibrosis model was established through the intraperitoneal injection with 1% dimethyl nitrosamine （DMN） with a dose of 1.0 mL·kg^-1·d^-1for consecutively three weeks， once for the first three days of each. The rats were randomly divided into six groups： the silymarin positive control group （50.0 mg·kg^-1·d^-1）， YCHD high （20.0 g·kg^-1·d^-1）， middle （8.0 g·kg^-1·d^-1） and low （3.2 g·kg^-1·d^-1） dose groups， the model group and the normal control group. The model group and the normal control group were orally administered with normal saline for consecutively five weeks. The pathologic changes in liver tissues were observed by HE staining. The levels of alanine aminotransferase（ALT）， aspartate aminotransferase（AST）， γ-glutamyltransferase（γ-GGT）， hyaluronic acid（HA）， laminin（LN）， collagen type Ⅳ（CⅣ） and type Ⅲ procollagen amino terminal peptide （PⅢNP） in serum were determined. The metabolite profiling of amino acid and the content of hydroxyproline in liver tissues were also measured. Result： Compared with the model group， YCHD high and middle dose groups could significantly reverse the pathologic changes in liver tissues of rats. YCHD could reduce the levels of ALT， AST， γ-GGT， HA， LN， CⅣ， PⅢNP in serum and the content of hydroxyproline in liver tissues in a dose-dependent manner， and altered the metabolite profiling of amino acid in rat liver tissues. Conclusion： YCHD has the effect in reversing dimethyl nitrosamine induced hepatic fibrosis in rats.

[Key words] Yinchenhao decoction； hepatic fibrosis； dimethyl nitrosamine； hydroxyproline

doi：10.4268/cjcmm20140822

[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint