侯士強(qiáng)+方明+陳莎莎+叢欣鵬+張大東+李新明

[摘要] 目的：探討積雪草苷能否作為生化調(diào)節(jié)劑，有效減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)一步抑制支架術(shù)后內(nèi)中膜增生。方法：選取原代人主動脈平滑肌細(xì)胞和主動脈成纖維細(xì)胞各1株，每株細(xì)胞設(shè)空白對照組、雷帕霉素組（Rapa）、積雪草苷組（At）、積雪草苷+雷帕霉素組。利用qRT-PCR檢測平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞TGF-β1（轉(zhuǎn)化生長因子1），Smad7，I型膠原基因表達(dá)水平，通過ELISA檢測I型膠原蛋白表達(dá)量，計(jì)算積雪草苷和雷帕霉素兩藥相互作用指數(shù)（CDI）。另將16只中華小型豬隨機(jī)分為A，B 2組，前降支球囊大壓力預(yù)擴(kuò)后，植入同型雷帕霉素支架1枚。術(shù)后A組予生理鹽水30 mL·d^-1靜脈注射；B組予積雪草苷30 mg·kg^-1·d^-1（生理鹽水稀釋至30 mL）靜注。術(shù)后7，14 d ELISA法檢測2組血漿vWF（血管性血友病因子）表達(dá)水平；術(shù)后28 d復(fù)查冠脈造影，取支架血管段組織切片及染色，計(jì)算血管面積、支架內(nèi)面積、管腔面積和新生內(nèi)膜面積。結(jié)果：與對照組相比，兩藥聯(lián)合組顯著上調(diào)平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞Smad7基因，下調(diào)TGF-β1，顯著抑制I型膠原基因表達(dá)（P<0.01）；平滑肌細(xì)胞中，兩藥聯(lián)合組與Rapa組對I型膠原抑制無顯著性差異，CDI為0.83；成纖維細(xì)胞中，兩藥聯(lián)合組優(yōu)于Rapa 組，存在顯著性差異（P<0.05），CDI為0.77。小型豬術(shù)后7，14 d，B組血漿vWF水平均顯著低于A組（P<0.05）；術(shù)后28 d，2組血管面積和支架內(nèi)面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；B組管腔面積顯著大于A組（P<0.05），B組新生內(nèi)膜面積顯著小于A組（P<0.05）。結(jié)論：積雪草苷通過上調(diào)Smad7蛋白表達(dá)，抑制TGF-β1表達(dá)，顯著減少胞外基質(zhì)合成與分泌，進(jìn)一步抑制支架術(shù)后內(nèi)中膜增生，減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，是雷帕霉素的有效生化調(diào)節(jié)劑。

[關(guān)鍵詞] 積雪草苷；雷帕霉素；Smad7；生化調(diào)節(jié)劑

[收稿日期] 2013-09-24

[基金項(xiàng)目] 上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（11ZR1431800）；上海市浦東新區(qū)領(lǐng)先人才基金項(xiàng)目（PWR12010-03）

[通信作者] 李新明，博士生導(dǎo)師，E-mail：xinmingli6@yahoo.com.cn

[作者簡介] 侯士強(qiáng)，碩士研究生，E-mail：houshiqiang@hotmail.com

支架術(shù)后再狹窄和支架術(shù)后遲發(fā)性血栓是目前經(jīng)皮冠脈介入治療（PCI）的主要問題。胞外基質(zhì)（ECM）約占支架術(shù)后再狹窄成分的80%，主要為I型膠原蛋白、彈力蛋白及α-平滑肌肌動蛋白，TGF-β1是調(diào)節(jié)ECM分泌的關(guān)鍵因子[1-5]。藥物支架在抑制血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和抑制內(nèi)中膜平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí)，也有效抑制了內(nèi)皮細(xì)胞增殖和修復(fù)，導(dǎo)致亞急性、遲發(fā)性支架內(nèi)血栓形成[6-7]。臨床上一直試圖尋找一種既能“顯著抑制增殖”，又具有“內(nèi)皮友好”功能的支架涂層藥物，但效果不佳。積雪草苷是積雪草中提取的單一大分子化合物，在皮膚創(chuàng)傷治療中具有抗炎和抗氧化作用，抑制成纖維細(xì)胞及胞外基質(zhì)合成，防止瘢痕生成[8-10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，積雪草苷可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并與長春新堿顯示協(xié)同作用[11]。鑒于以往研究經(jīng)驗(yàn)，本研究決定在不摒棄抗增殖藥物同時(shí)，根據(jù)免疫抑制劑特性，引入腫瘤治療領(lǐng)域中的“生化調(diào)節(jié)劑”概念。希望通過雷帕霉素聯(lián)合積雪草苷，能夠減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)一步抑制支架術(shù)后內(nèi)中膜增生。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 原代人主動脈平滑肌細(xì)胞株及培養(yǎng)基（美國Sciencell公司）；原代人主動脈成纖維細(xì)胞株及培養(yǎng)基（美國Sciencell公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑（美國Invitoren公司）；定量PCR試劑（日本Takara公司）；積雪草苷（蘇州寶澤堂）；雷帕霉素（上海微創(chuàng)公司）；引物由上海英駿生物有限公司設(shè)計(jì)合成。普通級中華實(shí)驗(yàn)用小型豬16只（華東師范大學(xué)閔行實(shí)驗(yàn)動物中心），體重25～35 kg，雌雄不限，6～8月齡；2.5/3.0 mm×15 mm雷帕霉素支架（上海微創(chuàng)公司）。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)和加藥 人主動脈成纖維和主動脈平滑肌細(xì)胞株各傳1代，分別使用ECM，F(xiàn)M，SM專用培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次，待細(xì)胞均勻鋪滿瓶底后，用0.25%胰酶和0.04%EDTA消化收集。將每株細(xì)胞按培養(yǎng)條件均分為對照組（Blank，加入溶劑二甲亞砜，DMSO），雷帕霉素組（Rapa，1×10^-9mol·L^-1），積雪草苷組（At，1×10^-5mol·L^-1），積雪草苷+雷帕霉素組（Combination，1×10^-5mol·L^-1+1×10^-9mol·L^-1），加藥后，培養(yǎng)48 h。收集上清，12 000 r·min^-1離心15 min后，吸取上清，-20 ℃保存，用于后續(xù)ELISA實(shí)驗(yàn)。收集細(xì)胞，直接抽提RNA，用于后續(xù)qRT-PCR檢測。

1.3 RT-PCR檢測 -80 ℃冰箱中取出RNA，0.2 mL PCR管中配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合溶液，預(yù)變性后在PCR管中配制cDNA第一鏈合成反應(yīng)體系。根據(jù)每基因進(jìn)行3孔平行反應(yīng)的量，在PCR 8聯(lián)管中配制反應(yīng)體系。將PCR管置于PCR儀，95 ℃ 30 s；隨后40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s。儀器使用ABI Prism 7900。引物序列見表1。

1.4 ELISA檢測及CDI計(jì)算 -20 ℃冰箱中取出上清，室溫下解凍，ELISA標(biāo)準(zhǔn)孔設(shè)置濃度梯度，樣品組每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)孔，每孔加10 μL樣品，孵育30 min棄去液體，洗板5次，然后加酶標(biāo)抗體孵育30 min，棄去液體洗板5次，加顯色劑避光孵育15 min，加終止液，酶標(biāo)儀測定A并計(jì)算出相應(yīng)濃度。計(jì)算兩藥聯(lián)合作用指數(shù)（CDI），CDI=AB/（A×B），AB為兩藥聯(lián)用組與對照組吸光度比值，A或B是各藥物單獨(dú)用藥組與對照組吸光度比值。理論上當(dāng)CDI<1時(shí)兩藥有協(xié)同作用。本研究設(shè)定：當(dāng)CDI<0.85時(shí)存在協(xié)同作用，CDI<0.80時(shí)協(xié)同作用較強(qiáng)。endprint

1.5 動物分組及再狹窄模型制備 將16只中華小型豬隨機(jī)分為A，B 2組，每組8只。所有小型豬術(shù)前3 d，每日喂服阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg。術(shù)前予小型豬安定3 mg·kg^-1，氯胺酮10 mg·kg^-1肌注麻醉，必要時(shí)靜脈追加3%戊巴比妥鈉3～5 mL。常規(guī)消毒鋪巾，手術(shù)分離右側(cè)股動脈，直視下穿刺置鞘，并予肝素200 U·kg^-1；行左、右冠脈造影，選取前降支直徑約2.5～3.0 mm的較平直血管段，定量冠脈造影（QCA）軟件測量直徑；送入預(yù)擴(kuò)張球囊，定位于前降支目標(biāo)血管段，按球囊/血管直徑1.2∶1，以16個(gè)大氣壓8～10 s快速預(yù)擴(kuò)張，并前后輕微拉動球囊，損傷血管內(nèi)中膜；送入雷帕霉素支架，完全覆蓋預(yù)擴(kuò)張部位，按球囊/血管直徑1.2∶1，以14～16個(gè)大氣壓，過度擴(kuò)張10～15 s釋放；退出支架球囊，重復(fù)冠脈造影，排除血管夾層和血栓，確保冠脈前向血流（TIMI）3級；結(jié)束手術(shù)，縫合股動脈及皮膚。術(shù)后每日仍予阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg喂服，術(shù)后A組予生理鹽水30 mL·d^-1靜脈注射；B組予積雪草苷30 mg·kg^-1·d^-1（生理鹽水稀釋至30 mL）靜注，直至28 d時(shí)動物處死。

1.6 ELISA法測定小型豬血漿vWF 術(shù)后7，14 d分別采集A，B 2組小型豬靜脈血，試管中加入0.109 mol·L^-1枸椽酸鈉抗凝液（與血液按體積1∶9混合），置于離心機(jī)3 000 r·min^-1離心10 min，收集上層血漿，放于-80 ℃ 冰箱保存；采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法測定血漿vWF含量。

1.7 支架血管段組織切片及HE染色 支架術(shù)后28 d復(fù)查冠脈造影，處死小型豬，分離冠狀動脈支架段血管，以4%多聚甲醛加壓沖洗管腔并固定。參考Buijs R方法[12]，將標(biāo)本依次經(jīng)70%，80%，90%乙醇脫水，100%甲基丙烯酸甲酯包埋，切片機(jī)20 μm連續(xù)切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS 17.0軟件包統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用方差分析，如方差分析拒絕無效假設(shè)，則采用Bonferrni法進(jìn)行2組間比較，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人主動脈平滑肌細(xì)胞和主動脈成纖維細(xì)胞RT-PCR檢測 與對照組相比，兩藥聯(lián)合組顯著上調(diào)人平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞Smad7基因，下調(diào)TGF-β1，顯著抑制I型膠原基因表達(dá)（P<0.05）；平滑肌細(xì)胞中，兩藥聯(lián)合組抑制效果略優(yōu)于雷帕霉素組，但無顯著性差異；成纖維細(xì)胞中，兩藥聯(lián)合組抑制效果顯著優(yōu)于雷帕霉素組（P<0.05），見表2。

2.2 人主動脈平滑肌細(xì)胞和主動脈成纖維細(xì)胞ELISA檢測 平滑肌細(xì)胞中，兩藥聯(lián)合組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量略低于雷帕霉素組，但無顯著性差異，CDI為0.83；成纖維細(xì)胞中，兩藥聯(lián)合組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量顯著低于雷帕霉素組（P<0.05），CDI為0.77，見表3。

2.3 小型豬再狹窄模型制備及冠脈造影結(jié)果 A，B 2組16只小型豬均順利完成術(shù)前冠脈造影及支架植入，但A組有1例小型豬在術(shù)后股動脈縫合過程中，因線結(jié)脫落，最終失血性休克死亡，被排除實(shí)驗(yàn)。術(shù)后28 d，15只小型豬均再次復(fù)查冠脈造影，并與術(shù)前造影圖像對比，觀察支架段血管變化，見圖1。2組均未見明顯支架再狹窄，但A組有3例小型豬，支架管腔邊緣模糊，冠脈血流較慢，血流TIMI 3-。

2.4 ELISA法檢測血漿vWF A組（n=7）術(shù)后第7，14天vWF抗原水平分別為（169.13±5.33）%，（148.82±4.37）%，B組（n=8）術(shù)后第7，14天vWF抗原水平分別為（131.26±4.42）%，（112.66±3.67）%。支架術(shù)后7，14 d時(shí)，B組vWF表達(dá)水平均顯著低于A組（P<0.05）。

2.5 病理學(xué)分析 術(shù)后28 d，A，B 2組支架血管段組織切片HE染色見圖2，支架段冠狀動脈的平均血管面積、支架內(nèi)面積、管腔面積和新生內(nèi)膜面積見表4。2組血管面積和支架內(nèi)面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；B組管腔面積顯著大于A組（P<0.05），B組新生內(nèi)膜面積顯著小于A組（P<0.05）。

3 討論

積雪草苷是積雪草中提取的三萜類單分子化合物，廣泛應(yīng)用于皮膚燒傷外科。體外應(yīng)用cDNA微控陣技術(shù)檢測積雪草苷對皮膚成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)譜作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)54種功能基因在不同時(shí)間位點(diǎn)顯著上調(diào)，包括負(fù)責(zé)細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)合成的特定功能基因[13]。研究發(fā)現(xiàn)，積雪草苷可作用于成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核，抑制細(xì)胞核分裂，減少細(xì)胞內(nèi)DNA合成，使核仁變小或缺失，細(xì)胞生長呈抑制狀態(tài)，抑制率隨用藥濃度增大而顯著增加，抑制率最高可達(dá)73%[14]。同時(shí)，積雪草苷還會引起成纖維細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松、內(nèi)容物減少，核蛋白體脫顆粒，顯著抑制膠原蛋白合成和分泌，并呈劑量依賴效應(yīng)[15]。因此，積雪草苷具有阻斷成纖維細(xì)胞生長增殖，抑制其合成分泌膠原蛋白的作用。有學(xué)者通過研究皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，積雪草苷可以顯著上調(diào)Smad7的mRNA表達(dá)，增加Smad7蛋白合成及向胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移，顯著抑制TGF-β1信號，減少Ⅰ型膠原蛋白分泌[10]。但積雪草苷對于血管損傷修復(fù)過程中的成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是否也存在同樣作用機(jī)制，目前缺乏相關(guān)研究。

PCI術(shù)后，血管外膜成纖維細(xì)胞會通過偽足向內(nèi)中膜遷移，并通過表型修飾，轉(zhuǎn)化為分泌性肌成纖維細(xì)胞；中膜平滑肌細(xì)胞會向內(nèi)膜遷移，并由收縮型轉(zhuǎn)化為分泌型[16]。表型修飾后的平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞通過遷移、增殖，大量分泌膠原、蛋白多糖等胞外基質(zhì)（ECM），約占支架術(shù)后再狹窄成分的80%，I型膠原蛋白是其中主要成分，而TGF-β1則是上游調(diào)節(jié)I型膠原蛋白分泌的關(guān)鍵因子[1-5]。endprint

研究顯示，相對于雷帕霉素單一用藥組，兩藥聯(lián)合組無論在平滑肌細(xì)胞還是成纖維細(xì)胞中，均能顯著下調(diào)TGF-β1，進(jìn)一步抑制I型膠原蛋白表達(dá)，雖然在平滑肌細(xì)胞中沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但CDI 0.83仍提示有較明顯的協(xié)同作用。雷帕霉素主要針對雷帕霉素靶蛋白，通過PI3K/AKT通路抑制TGF-β1，但TGF-β1同時(shí)還受Smads蛋白信號通路調(diào)節(jié)，而積雪草苷則能通過顯著上調(diào)Smad7基因，抑制TGF-β1表達(dá)，因而具有協(xié)同作用，這一點(diǎn)在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)[10，17]。

血管性血友病因子（vWF）是一種具有黏附功能的大分子糖蛋白，內(nèi)皮細(xì)胞是vWF合成和貯存的主要場所，vWF升高常作為內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的標(biāo)志因子[18]；支架術(shù)后24 h即可出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞再生，約2周時(shí)再生速度達(dá)到最大，至6周后內(nèi)皮修復(fù)逐漸減慢，趨于停止[19]。有研究顯示，支架再狹窄模型中，豬冠狀動脈1個(gè)月的改變類似于人類冠狀動脈6個(gè)月的改變[20]。因此，以28 d作為小型豬再狹窄模型的隨訪期。

在中華小型豬模型中，由于手術(shù)損傷大量內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)支架術(shù)后即刻vWF表達(dá)水平最高；此后，隨著雷帕霉素釋放濃度逐漸降低，vWF表達(dá)水平也隨之下降。但不管在術(shù)后7 d內(nèi)皮細(xì)胞再生高峰，還是術(shù)后14 d內(nèi)皮再生速度減緩，B組由于積雪草苷干預(yù)，vWF表達(dá)水平始終顯著低于A組，說明積雪草苷顯著減少雷帕霉素導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與抗氧化作用有關(guān)[9]。

小型豬術(shù)后28 d復(fù)查冠脈造影，與支架術(shù)后即刻造影相比，2組冠脈支架植入處均未見明顯狹窄，但A組有3例小型豬支架管腔邊緣模糊，冠脈血流TIMI 3-。由于術(shù)前采用球囊大壓力預(yù)擴(kuò)，來回牽拉，并且支架過度釋放，所以對于血管內(nèi)膜的損傷要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常PCI手術(shù)。A組小型豬邊緣模糊可能與內(nèi)中膜增生有關(guān)，而冠脈血流減慢則可能是由于內(nèi)皮細(xì)胞大量受損，炎性反應(yīng)激活，抑制內(nèi)皮細(xì)胞對NO等相關(guān)因子釋放，導(dǎo)致血管收縮和舒張活動減弱所致。2組小型豬模型的血管面積和支架內(nèi)面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但B組管腔面積顯著大于A組（P<0.05），B組新生內(nèi)膜面積顯著小于A組（P<0.05），說明積雪草苷在顯著減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷同時(shí)，可以協(xié)同雷帕霉素進(jìn)一步抑制支架術(shù)后內(nèi)中膜增生，是雷帕霉素防止再狹窄過程中的有效生化調(diào)節(jié)劑。

本研究存在一定局限，小型豬冠狀動脈術(shù)前并無粥樣硬化，且動物實(shí)驗(yàn)的樣本量較小，隨訪時(shí)間偏短，這些可能一定程度上影響統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果。在接下來的研究中，將擴(kuò)大樣本量至30頭小型豬，延長隨訪時(shí)間至6～12個(gè)月，以進(jìn)一步觀察積雪草苷在防治支架再狹窄過程中的生化調(diào)節(jié)作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Chung I M， Gold H K， Schwartz S M， et al.Enhanced extracellular matrix accumulation in restenosis of coronary arteries after stent deployment[J]. J Am Coll Cardiol， 2002， 40（12）：2072.

[2] Fattori R， Piva T. Drug-eluting stents in vascular intervention[J]. Lancet， 2003，361：247.

[3] Berk B C. Vascular smooth muscle growth： autocrine growth mechanisms[J]. Physiol Rev， 2001， 81：999.

[4] Leask A， Abraham D J. TGF-beta signaling and the fibrotic response[J]. FASEB J， 2004，18（7）：816.

[5] Amento E P， Ehsani N， Palmer H， et al. Cytokines and growth factors positively and negatively regulate interstitial collagen gene expression in human vascular smooth muscle cells[J]. Arterioscler Thromb， 1991，11：1223.

[6] Joner M， Finn A V， Farb A， et al. Pathology of drug-eluting stents in humans： delayed healing and late thrombotic risk[J]. J Am Coll Cardiol， 2006， 48：193.

[7] Nührenberg T G， Voisard R， Fahlisch F， et al. Rapamycin attenuates vascular wall inflammation and progenitor cell promoters after angioplasty[J]. FASEB J， 2005， 19：246.

[8] Shukla A， Rasik A M， Jain G K， et al. In vitro and in vivo wound healing activity of asiaticoside isolated from Centella asiatica[J]. J Ethnopharmacol， 1999， 65（1）：1.

[9] Shukla A， Rasik A M， Dhawan B N. Asiaticoside-induced elevation of antioxidant levels in healing wounds[J]. Phytother Res， 1999，13（1）：50.endprint