余良主+石春蓉

[摘要] 目的：探討丹參酮Ⅱ_A（Tan）對腎性高血壓大鼠肥厚左心室肌中腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）不同成分表達的影響。方法：建立大鼠兩腎一夾型腎血管性高血壓模型。實驗中，所有大鼠在手術前即被隨機分為4組（n=15）：假手術（Sham）組、高血壓模型（Model）組、丹參酮Ⅱ_A低、高劑量組。給藥組于腎動脈縮窄術后第5周開始分別給予丹參酮Ⅱ_A35，70 mg·kg^-1·d^-1。術后每周采用標準尾套法檢測大鼠血壓。給藥8周后處死大鼠，分離左心室，用于檢測左心室重/體重、心肌膠原含量、心肌RAS不同成分表達量，包括血管緊張素轉換酶（ACE）、血管緊張素轉換酶2（ACE2）、血管緊張素1型受體（AT₁R）和Mas受體的mRNA表達量，以及心肌血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、血管緊張素（1-7）[Ang（1-7）]含量。結果：與假手術組相比，高血壓模型組大鼠肥厚左心室中AngⅡ，Ang（1-7）含量（P<0.01）以及ACE，ACE2，AT₁R和Mas mRNA表達量均明顯增多（P<0.01）。而應用丹參酮Ⅱ_A治療則劑量依賴性抑制了腎性高血壓大鼠左心室肥厚，減少了心肌AngⅡ含量，ACE，AT₁R mRNA表達量（P<0.01），并且也進一步提高了心肌Ang（1-7）含量，ACE2和Mas mRNA表達量（P<0.01）。但是，丹參酮Ⅱ_A治療并不影響高血壓大鼠的血壓。結論：丹參酮Ⅱ_A治療可抑制腎性高血壓大鼠左室肥厚的發(fā)生，其機制可能至少部分與調節(jié)心肌組織中腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）不同成分的表達相關。

[關鍵詞] 丹參酮Ⅱ_A；心肌細胞；腎素-血管緊張素系統(tǒng)；肥厚

[收稿日期] 2013-08-26

[基金項目] 湖北省教育廳科學技術研究項目（B20122804）；湖北科技學院科學研究項目（BK1104，ZX1201）

[通信作者] 余良主，博士，副教授，從事心肌肥厚的發(fā)生機制及防治研究工作，E-mail： yuliangyu73@sina.com

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）是對心血管功能具有調節(jié)作用的最重要體液機制之一。經典RAS的主要成分包括腎素、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、血管緊張素轉換酶（ACE）等[1]。這些經典成分（如AngⅡ，ACE等）都在心臟中有表達，并且參與高血壓心臟病的發(fā)生發(fā)展[2]。此外，近年研究還發(fā)現(xiàn)了許多新的RAS成分，如血管緊張素轉換酶2（ACE2）、血管緊張素（1-7）[Ang（1-7）]及其受體Mas蛋白等[3]。這些新成分被證實是抑制高血壓形成的因素。而在高血壓、慢性心力衰竭、糖尿病等病理生理狀態(tài)下，這些新成分還與相應經典RAS成分互相拮抗[4]。靶向干預這些新成分則被認為是今后防治心血管疾病的新發(fā)展方向。

丹參酮Ⅱ_A是中藥丹參中的主要活性成分之一。丹參酮Ⅱ_A近年來被證實可抑制腹主動脈縮窄型高血壓[5]及兩腎兩夾型高血壓[6]大鼠的心肌肥厚。但是，其作用機制并不十分清楚。為此，本研究擬在兩腎一夾型高血壓大鼠模型中，探討丹參酮Ⅱ_A對高血壓大鼠肥厚性左心室肌中RAS不同成分表達的影響，為該藥在心血管疾病防治中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 丹參酮Ⅱ_A磺酸鈉（上海第一生化藥業(yè)有限公司）；羥脯氨酸測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Trizol（美國Invitrogen公司）；AngⅡ，Ang（1-7） ELISA試劑盒（USCN公司）；其他試劑為國產分析純。

1.2 動物 健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重（200±20） g，購自湖北省實驗動物研究中心，合格證號SCXK（鄂）2008-0005。實驗前大鼠適應性喂養(yǎng)5 d，自由進食進水。

1.3 儀器 電熱鼓風干燥箱（重慶四達試驗設備有限公司）；WD-9403C分光光度計（北京市六一儀器廠）；PCR儀、恒壓恒流電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國伯樂公司）。

2 方法

2.1 腎性高血壓模型制作 SD大鼠經3%戊巴比妥鈉（30 mg·kg^-1）腹腔注射麻醉，右側臥位固定，暴露左側腎動脈。將銀夾（內徑0.25 mm）固定于左側腎動脈上，使其部分縮窄。隨后，縫合和關閉創(chuàng)口。術后3 d內每天腹腔注射青霉素以防感染。術后每周采用標準尾套法測量大鼠尾動脈血壓1次。以術后第4周末血壓超過18.7 kPa（=140 mmHg）[7]且較之術前血壓高出20 mmHg 以上為高血壓模型成功標志，方可用于后續(xù)藥物實驗，納入實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計。假手術組大鼠手術過程基本與高血壓模型組相同，但左側腎動脈不放置銀夾。

2.2 分組 實驗分組及給藥如下：假手術組（Sham）、高血壓模型組（Model）、丹參酮Ⅱ_A低、高劑量組，給藥組于術后第5周開始灌飼丹參酮Ⅱ_A（35，70 mg·kg^-1·d^-1）。丹參酮Ⅱ_A給藥劑量參照相關文獻[6]。假手術組、高血壓模型組給予同等容積的生理鹽水。給藥8周后，檢測各組大鼠的體重（BW）及血壓。將大鼠斷頭處死，快速分離其左心室肌及室間隔，稱重（LVW）。計算左心室重/體重（LVW/BW）。另外，取部分左心室肌，用于檢測心肌膠原含量、不同RAS成分mRNA的表達量。endprint

2.3 心肌膠原含量檢測 由于膠原蛋白中羥脯氨酸的含量較為固定，約為13.4%，因而組織中膠原蛋白含量通常是通過檢測其中羥脯氨酸的含量，此數(shù)值乘以7.46來計算的[8]。本研究中，羥脯氨酸含量的檢測參照試劑盒說明操作。稱取100 mg心肌組織勻漿，加至6 mol·L^-1鹽酸中經120 ℃酸解6 h，用NaOH調節(jié)pH至7.0。3 500 r·min^-1離心10 min。取部分上清液做檢測，按照試劑盒說明操作。最后在UV-754型分光光度計558 nm處比色測定。測定時，同時設定測定管、標準管和空白管，蒸餾水調零，測定各管吸光度。按照試劑盒說明所列公式計算心肌羥脯氨酸含量，換算成每克心肌組織的羥脯氨酸含量，此數(shù)值乘以7.46即得心肌膠原含量（mg·g^-1）。

2.4 心肌AngⅡ，Ang（1-7）含量檢測 取心肌100 mg研磨、加PBS勻漿，3 000 r·min^-1離心15 min。取上清液，于-80 ℃保存待測。ELISA檢測AngⅡ，Ang（1-7）水平，操作嚴格按照試劑盒的要求進行。

2.5 心肌RAS成分mRNA表達量檢測 采用RT-PCR法檢測心肌組織ACE，AT₁R，ACE2，Mas受體mRNA表達量。采用Trizol法提取心肌組織總RNA，以總RNA為模板逆轉錄合成互補的cDNA。最后，以cDNA為模板，加入特異引物、PCR反應緩沖液等，構成PCR反應體系，在下述反應溫度條件下PCR擴增目的基因序列。各目的基因的引物見表1。PCR擴增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58～62 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)。擴增反應在BioRAD iCycler iQ型定量PCR儀（Bio-Rad Laboratories，美國）中進行。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶被掃描并儲存為tiff圖片。采用Image J （NIH， Bethesda，美國）軟件，對電泳條帶的吸光度值進行檢測分析。GAPDH為內參照基因，以目的基因表達量/GAPDH表達量為目的基因的相對表達量。每組實驗重復3次。

2.6 統(tǒng)計學分析 全部數(shù)據(jù)以±s表示，應用SPSS 12.0軟件作單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 丹參酮Ⅱ_A治療并不影響高血壓大鼠的血壓 本實驗中，安放銀夾的SD大鼠大多數(shù)在術后第4周末明顯升高，被確認為高血壓形成。也有部分大鼠（包括高血壓模型組5只、低劑量丹參酮Ⅱ_A組3只、高劑量丹參酮Ⅱ_A組4只）雖然安放有銀夾，但其血壓沒有明顯升高，而從統(tǒng)計數(shù)據(jù)剔除。結果顯示，在腎動脈狹窄術后第12周末，高血壓模型組大鼠的血壓明顯高于同期假手術組（P<0.01）。不同劑量丹參酮Ⅱ_A組大鼠的血壓均與高血壓模型組相近，差異無顯著性，見表2。

3.2 丹參酮Ⅱ_A治療抑制了高血壓大鼠的肥厚 左心室重/體重（LVW/BW）是衡量高血壓心肌肥厚的常用指標。腎動脈狹窄術后12周末，高血壓模型組大鼠LVW/BW較同期假手術組明顯增高（P<0.01）。丹參酮Ⅱ_A治療呈劑量依賴性降低高血壓大鼠的LVW/BW（P<0.01），見表2。

3.3 丹參酮Ⅱ_A治療減少了高血壓大鼠心肌膠原的含量 與假手術組相比，高血壓模型組心肌膠原含量明顯增多（P<0.01）；而高、低劑量丹參酮Ⅱ_A組心肌膠原含量均明顯低于高血壓模型組（P<0.01），見表2。

3.4 丹參酮Ⅱ_A治療抑制了高血壓大鼠心肌中促高血壓RAS成分的表達 與假手術組相比，高血壓模型組心肌中AngⅡ含量，ACE，AT₁R mRNA表達量明顯增多（P<0.01）。反過來，與高血壓模型組相比，高、低劑量丹參酮Ⅱ_A組大鼠心肌AngⅡ含量，ACE，AT₁R mRNA表達量均明顯降低（P<0.01），見圖1。

3.5 丹參酮Ⅱ_A治療增強了高血壓大鼠心肌中抗高血壓RAS成分的表達 與假手術組相比，高血壓模型組心肌中Ang（1-7）含量，ACE2，Mas mRNA表達量均增多（P<0.01）。但是，與高血壓模型組相比，高、低劑量丹參酮Ⅱ_A組大鼠心肌中ACE2，AT₂R，Mas受體mRNA表達量卻進一步增多，見圖2，3。

4 討論

高血壓病的一個重要特征即是循環(huán)及心血管局部RAS的過度激活[9]。經典RAS成分[例如ACE，AngⅡ，血管緊張素Ⅱ1型受體（AT₁R）]活化時，主要是AngⅡ生成增多，AngⅡ作用于細胞膜AT₁R，引起各種效應，包括增強血管收縮反應、促進血管壁肥厚，而促進高血壓的形成和發(fā)展；促進心肌細胞肥大、心臟成纖維細胞增生以及心肌間質增生堆積，而導致心肌肥厚和纖維化[1-2]。

而近年研究發(fā)現(xiàn)了一些新的RAS成分：ACE2，Ang（1-7），Ang（1-7）受體Mas等[3]。ACE2主要是催化AngⅡ轉變?yōu)锳ng（1-7）。ACE2也可催化血管緊張素I水解，轉化為血管緊張素1-9，后者再由ACE催化為Ang（1-7）。而Ang（1-7）的作用主要是通過其受體Mas介導。由于ACE2催化AngⅡ水解為Ang（1-7）的活性遠遠高于對血管緊張素I的催化作用，故而ACE2的作用被認為主要是促進AngⅡ水解轉化為Ang（1-7）[10]。據(jù)此，把ACE2，Ang（1-7），Mas三者稱為所謂ACE2-Ang（1-7）-Mas軸，此軸的關鍵作用在于Ang（1-7）。Ang（1-7）可通過與其受體Mas相結合，產生多種與AngⅡ相對抗的作用。首先，ACE抑制劑和AT₁R拮抗劑的抗高血壓作用被認為依賴Ang（1-7）的介導[11-12]。其次，Ang（1-7）能減弱糖尿病性高血壓大鼠腎血管對AngⅡ的高反應性[13]。第三，Ang（1-7）能在不影響血壓的情況下直接抑制AngⅡ誘導的心臟結構性重塑[14]，這使得它對高血壓狀態(tài)下的心臟可能具有一定的保護作用。因而，靶向性增加Ang（1-7）產生被認為可能對治療高血壓心臟病有效[14]。endprint

本研究結果顯示，高血壓大鼠肥厚心肌中促高血壓的經典RAS成分（ACE，AngⅡ，AT₁R）以及新的抗高血壓RAS成分[ACE2，Ang（1-7），Mas] 的mRNA表達量均明顯增加。那么，在經典促高血壓RAS成分與新的抗高血壓RAS成分之間，究竟是誰在高血壓大鼠心臟中發(fā)揮著主要作用呢？通過對Ang（1-7）/AngⅡ和ACE2/ACE的計算，發(fā)現(xiàn)高血壓組大鼠心肌的Ang（1-7）/AngⅡ和ACE2/ACE均低于假手術組。這提示，在高血壓大鼠心臟中新的抗高血壓RAS成分處于相對表達不足的狀態(tài)，這可能導致高血壓大鼠心臟中主要表現(xiàn)為促高血壓RAS成分過度激活的作用，即心肌肥厚和膠原堆積。而應用丹參酮Ⅱ_A治療，雖然未能降低高血壓，但在抑制心肌肥厚和膠原堆積的同時，既降低心肌中促高血壓RAS成分（ACE，AngⅡ，AT₁R）的表達，又進一步增強抗高血壓RAS成分[ACE2，Ang（1-7），Mas]的表達。盡管血液循環(huán)中RAS成分也有可能促進心肌肥厚的發(fā)生，但是現(xiàn)有研究顯示心臟局部產生的RAS成分在高血壓心臟肥厚中起著更為重要的作用[15]。據(jù)此推測，丹參酮Ⅱ_A對RAS這些不同成分表達的調控作用，至少部分地促進了高血壓大鼠心肌肥厚及纖維化的消退。

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Effect of tanshinone Ⅱ_Aon expression of different components in

renin-angiotensin system of left ventricles of hypertensive rats

YU Liang-zhu， SHI Chun-rong

（School of Basic Medicine， Hubei University of Science and Technology， Xianning 437100， China）

[Abstract] Objective： To investigate the effect of tanshinoneⅡ_Aon the expression of different components in the renin-angiotensin system of left ventricles of renal hypertensive rats. Method： The renal hypertension model was established in rats by the two-kidney-one-clip （2K1C） method. In the experiment， all of the rats were randomly divided into four groups （n=15 per group） before the operation： the sham-operated （Sham） group， the hypertensive model （Model） group， the low-dose tanshinoneⅡ_Agroup and the high-dose tanshinoneⅡ_Agroup. At 5 week after the renal artery narrowing， the third and fourth groups were administered with 35 mg·kg^-1·d^-1and 70 mg·kg^-1·d^-1of tanshinone Ⅱ_A， respectively. The blood pressure in rats was determined by the standard tail-cuff method in each week after the operation. After the drug treatment for 8 weeks， all the rats were put to death， and their left ventricles were separated to determine the ratio of left ventricle weight to body weight （LVW/BW）， the myocardial collagen content， and the expressions of different components in myocardial RAS， including angiotensin converting enzyme（ACE）， angiotensin converting enzyme 2（ACE2）， angiotensin 1-type receptor（AT₁R）， Mas receptor mRNA expression and angiotensin Ⅱ（AngⅡ） and angiotensin（1-7）[Ang（1-7）] content. Result： Compared with the sham group， the hypertensive model group exhibited a markable increase in the content of AngⅡ and Ang（1-7） and the mRNA expressions of ACE， ACE2， AT₁R and Mas （P<0.01）. However， the treatment with tanshinone Ⅱ_Ashowed the does dependence， inhibited left ventricle hypertrophy， decreased myocardial AngⅡ content and the mRNA expression of ACE and AT₁R in renal hypertensive rats （P<0.01）， further increased the myocardial Ang （1-7） content and the mRNA expression of ACE2 and Mas （P<0.01）， but without any change in the blood pressure of hypertensive rats. Conclusion： The treatment with tanshinone Ⅱ_Acould inhibit left ventricle hypertrophy of renal hypertensive rats. Its mechanism may be partially related to the expression of different components in the renin-angiotensin system for regulating myocardial tissues.

[Key words] tanshinone Ⅱ_A； cardiomyocyte； renin-angiotensin system； hypertrophy

doi：10.4268/cjcmm20140821

[責任編輯 張寧寧]endprint