虞楊，劉冬蕊，汪羽，方國臻，王碩

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

速滅威（Metolcarb，3-甲苯基-N-甲基氨基甲酸酯）是氨基甲酸酯類殺蟲劑的主要品種之一，廣泛使用在稻田、蔬菜、水果等農作物的害蟲防治[1]。分子式為C9H11NO2，結構式如圖1所示。

圖1 速滅威的分子結構Fig.1 Chemical structure of carbamate

人們食用殘留速滅威農藥的蔬果后，農藥就會在人體內積蓄甚至造成人體急性或慢性中毒。為了避免速滅威農藥殘留給人類帶來的危害，發(fā)展快速、可靠、靈敏的食品中速滅威殘留分析方法具有重要的現(xiàn)實意義。

分子印跡技術是由著名的諾貝爾獎獲得者Pauling[2]提出的。它是將模板分子與功能單體通過共價鍵或非共價鍵作用形成配合物，加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑，聚合形成一個高度交聯(lián)的剛性分子。洗脫去除模板分子后，分子印跡聚合物的網(wǎng)絡結構中留下了在空間大小、結合位點與模板分子互補的三維立體孔穴，表現(xiàn)出對印跡模板分子高度的選擇性識別能力[3-8]。

目前，分子印跡技術主要應用于固相萃取、色譜分離和免疫分析。由于傳感器檢測技術具備分析速度快、成本低，可在線檢測等特點，優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測方法，因此將分子印跡聚合物當做敏感材料用于制備傳感器（分子印跡聚合物傳感器）成為食品安全檢測領域重要的發(fā)展方向。本實驗通過合成一種熒光功能單體，制備出具有選擇識別性能的熒光分子印跡聚合物，旨在為食品中農藥殘留檢測提供一種新的手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

速滅威、殘殺威、異丙威、仲丁威、2-氨基吡啶、乙二醇二甲基丙烯酸酯：美國Sigma公司；丙烯酰氯：上海aladdin試劑有限公司；甲基丙烯酸、甲醇、甲苯、乙腈：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；偶氮二異丁腈：天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；集熱式加熱磁力攪拌器（DF-101Z）：鄭州長城科工貿有限公司；電熱式恒溫水浴鍋（SY型）：天津歐諾儀器儀表有限公司；超聲波清洗器（KQ-500B）：昆山市超聲儀器有限公司；臺式冷凍離心機（Centrifuge 5804R）：德國 Eppendorf公司；旋轉蒸發(fā)器（RE-3000）：上海亞榮生化儀器廠；紫外可見分光光度計（Cary50-Bio）：澳大利亞Victoria公司；熒光分光光度計（F-2500）：日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光功能單體的制備

準確稱量1.882 g 2-氨基吡啶置于100 mL圓底燒瓶中，加入20 mL二氯甲烷，室溫攪拌10 min，逐滴加入三乙胺2.79 mL后，再緩慢滴加丙烯酰氯1.79 mL，補加20 mL二氯甲烷，室溫攪拌反應24 h。旋蒸除去溶劑后加入乙酸乙酯攪拌4 h，過濾，濾渣用乙酸乙酯洗滌兩次，合并濾液，用0.22 μm的有機濾膜過濾，旋蒸除去乙酸乙酯溶劑，即制得2-氨基吡啶丙烯酰胺熒光功能單體，低溫干燥備用。

1.2.2 速滅威分子印跡聚合物的合成

在25.00 mL的具塞圓底燒瓶中加入33.00 mg速滅威，與0.50 mL乙腈和0.50 mL甲苯磁力攪拌使其完全溶解，然后加入熒光功能單體2-氨基吡啶丙烯酰胺29.60 mg，磁力攪拌反應30 min后，加入輔助功能單體甲基丙烯酸（MAA）34 μL，攪拌反應 4 h，加入交聯(lián)劑EDMA 752 μL，再加入 20.00 mg引發(fā)劑 AIBN，超聲氮吹后孵育熱聚合。制得的分子印跡聚合物充分研磨、過篩，最后進行索氏提取。非分子印跡聚合物除不加模板分子速滅威外，其余操作步驟與上述過程相同。

1.2.3 熒光分子印跡聚合物對速滅威的平衡結合實驗

準確稱取10 mg的分子印跡聚合物于1.5 mL安道管中，分別加入 1 mL 不同濃度（0、10、20、30、40、60、80、100 mg/L）的速滅威甲醇溶液，充分震蕩。取懸濁液稀釋100倍，測定熒光強度。同時平行做非印跡聚合物對速滅威的平衡結合實驗。使用熒光分光光度計測定時激發(fā)波長設定為300 nm。

1.2.4 吸附動力學實驗

準確稱取10 mg速滅威分子印跡聚合物于1.5 mL安道管中，加入1 mL 40 mg/L的速滅威甲醇標準溶液，在室溫下分別振蕩 10、20、30、60、120、180 min，取懸濁液稀釋100倍，測定熒光強度。測定條件與平衡結合實驗相同。

1.2.5 熒光選擇性吸附實驗

分別準確稱取多份10 mg印跡、非印跡材料于1.5 mL安道管中，分別各加入1 mL的甲醇溶液作空白，1 mL濃度為50 mg/L的速滅威甲醇溶液、1 mL濃度為50 mg/L的殘殺威甲醇溶液、1 mL濃度為50 mg/L的異丙威甲醇溶液、1 mL濃度為50 mg/L的仲丁威甲醇溶液，充分震蕩，取懸濁液稀釋100倍，分別測定各種底物在印跡聚合物和非印跡聚合物上的熒光強度。

2 結果與討論

2.1 溶劑的選擇

實驗選用了乙腈、乙酸乙酯、四氫呋喃為聚合反應的溶劑進行研究，用吸附容量評價聚合物的吸附性能[9]，結果見表 1。

表1 合成聚合物的溶劑的選擇Table 1 Various solvent investigated for the preparation of the polymers of Metolcarb

雖然四氫呋喃（THF）的極性很低，比較適合作為反應溶劑，但是對于本實驗采用其合成的聚合物吸附效果并沒有乙腈的好，并且溶解在四氫呋喃中的熒光功能單體需超聲30 min才能較好的溶解；實驗中加入甲苯作為致孔劑，以增加聚合物孔徑的大小和數(shù)量，提高模板分子在聚合物中的傳質速度，改善響應時間。從吸附容量的大小可以看出，在模板分子、功能單體和交聯(lián)劑用量相同的情況下，使用乙腈作為致孔劑的聚合物吸附效果較好，且加入甲苯后明顯改善了聚合物的吸附效果和特異性，因此，優(yōu)化后的溶劑確定為0.5 mL乙腈和0.5 mL甲苯。

2.2 模板分子、功能單體和交聯(lián)劑的配比

由于甲基丙烯酸（MAA）為實驗常用的性能良好的功能單體，并且MAA的羧基能與速滅威上的胺基形成氫鍵，為進一步改善印跡聚合物的識別性能，本實驗中采用了輔助功能單體MAA參與聚合過程。在初步優(yōu)化的模板分子、熒光功能單體和交聯(lián)劑比例的基礎上，繼續(xù)優(yōu)化了各反應物的比例，如表2所示。

表2 模板分子、功能單體和交聯(lián)劑合成聚合物的配比Table 2 Various ratios of template molecule，fluorescent functional monomer，co-monomer，cross-linker investigated for the preparation of the polymers

由表2可以看出，進一步優(yōu)化后的印跡聚合物吸附性能得到了明顯的提高，這說明加入輔助功能單體MAA后，增加了印跡聚合物中額外的氫鍵結合位點。過高的交聯(lián)劑比例對聚合物的識別性和選擇性沒有改善，同時減小熒光單體和改變MAA的比例會導致聚合物吸附性能變差。本實驗最終確定的模板分子、熒光功能單體、輔助功能單體（MAA）和交聯(lián)劑（EDMA）的摩爾比例為 1∶1∶1∶20，該條件合成的聚合物剛性適中，提高了聚合物的選擇性和識別性。

2.3 熒光分子印跡聚合物對速滅威的平衡結合

熒光分子印跡聚合物對速滅威的平衡結合見圖2。

圖2 印跡聚合物吸附不同濃度速滅威的熒光光譜圖Fig.2 The curve of fluorescence intensity after adsorbing different concentration of metolcarb using MIP

由圖2可以看出，合成的熒光分子印跡聚合物與不同濃度的速滅威相互作用后，產(chǎn)生了不同的熒光信號變化，隨著速滅威濃度的增大，聚合物懸濁液的熒光強度相應的減小。這說明合成的熒光分子印跡聚合物對速滅威有吸附作用，并且在吸附速滅威后，熒光發(fā)生了不同程度的猝滅，完成了將吸附濃度的大小轉變成相應熒光強度的過程，起到了熒光傳感器的作用。同時，非印跡聚合物對不同濃度的速滅威也有一定程度的響應，但是它對速滅威濃度的響應不如印跡聚合物的顯著，隨目標物濃度的變化其熒光猝滅的程度較小，這說明了非印跡聚合物對模板分子速滅威也有一定程度的吸附，但主要是非特異性吸附，不具備印跡聚合物對目標物有特異性吸附的良好性能。

2.4 熒光分子印跡聚合物對速滅威的吸附動力學

在3 h內不同的時間條件下，研究了印跡聚合物吸附相同濃度的速滅威后熒光強度隨時間的變化趨勢，見圖3。

圖3 印跡聚合物的相對熒光強度隨時間的變化曲線Fig.3 The curve of relative fluorescence intensity with the change of time using MIP

圖3表明，在30 min內印跡聚合物的初始熒光強度I0與吸附速滅威后的熒光強度I比值隨時間明顯增大，這是因為在不同時間下印跡聚合物吸附速滅威后，熒光發(fā)生了不同程度的猝滅。隨著時間的增加，聚合物對模板分子的吸附基本完全，猝滅程度也趨于穩(wěn)定，熒光強度值基本保持不變。由圖3可知，印跡聚合物在2 h內已經(jīng)完成97.7%的吸附，說明吸附速度較快，該聚合物具有較好的傳質速度和吸附性能。

2.5 熒光分子印跡聚合物對速滅威的選擇性

選擇3種與模板分子速滅威結構類似的化合物殘殺威、異丙威和仲丁威進行熒光聚合物對不同底物吸附效果研究，實驗中分別固定各底物的濃度相同并吸附相同的時間，結果見圖4。

圖4 聚合物對不同底物的熒光選擇性Fig.4 Fluorescent selective adsorption of different substrates for using MIP and NIP

由圖4可知印跡聚合物對速滅威的熒光響應最顯著，說明熒光猝滅最明顯。雖然殘殺威、異丙威和仲丁威的熒光強度值也發(fā)生了下降，但是不如速滅威下降明顯，這可能是因為合成的熒光分子印跡聚合物具有對模板分子速滅威特定識別的孔穴和位點，其他的類似物與速滅威的形狀和大小存在差異，因此不能被更好的吸附，也就不能通過熒光信號傳導表現(xiàn)為熒光強度值更多的減??；非印跡聚合物中的熒光信號來源于聚合物中的熒光單體，但是與底物發(fā)生吸附作用時完全憑借聚合過程中形成的無序空腔，因此表現(xiàn)為非印跡聚合物吸附4種物質后的熒光猝滅程度相差不多。這也進一步說明了合成的熒光印跡聚合物對模板分子速滅威具有較高的選擇性和識別性。

3 結論

采用本體聚合的方法，以速滅威為模板分子，2-氨基吡啶丙烯酰胺為熒光功能單體，甲基丙烯酸為輔助功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，合成了對速滅威有吸附作用的熒光分子印跡聚合物。實驗表明，溶劑的選擇和不同反應物之間的比例組成主要影響聚合物的選擇性識別能力。將合成的印跡聚合物作為熒光傳感器，對不同濃度的目標物以及吸附不同的時間均有不同的響應；對類似物的響應識別也存在明顯差異，這為分子印跡聚合物應用于熒光傳感器提供了思路，具有廣闊的開發(fā)前景。

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