彭利靜，拓步雄，李超民

解放軍第451醫(yī)院 心血管內(nèi)科，陜西 西安 710054

動(dòng)脈鈣化主要指鈣以磷酸鹽形式沉積在動(dòng)脈壁組織的一種病理改變。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為血管鈣化是鈣鹽在細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外基質(zhì)的被動(dòng)沉積，但最近的研究發(fā)現(xiàn)，血管鈣化形成的早期類似骨細(xì)胞形成，這個(gè)過程是主動(dòng)、可預(yù)防、可逆轉(zhuǎn)和高度可調(diào)控的生物學(xué)過程，因此動(dòng)脈鈣化發(fā)生早期的中心環(huán)節(jié)是血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）、血管周邊細(xì)胞等向成骨樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[1]。

骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）及核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear fac?tor κB ligand，RANKL）是最近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)動(dòng)脈鈣化發(fā)生的重要因子，而且有大量的細(xì)胞因子能夠調(diào)節(jié)OPG/RANKL的水平，但在動(dòng)脈鈣化發(fā)生中OPG/RANKL上游信號(hào)目前尚不清楚[2]。我們前期的工作發(fā)現(xiàn)鈣化發(fā)生過程中Nalp3炎癥小體復(fù)合體的激活，提示Nalp3炎癥小體復(fù)合體可能作為其上游信號(hào)，通過改變OPG/RANKL水平來調(diào)節(jié)鈣化發(fā)生。在此，我們通過caspase-1抑制劑zVAD來抑制Nalp3炎癥小體的激活，并檢測(cè)OPG/RANKL的表達(dá)水平及其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠，體質(zhì)量約150 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；茜素紅、β-磷酸甘油酯（β-GP）購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；zVAD、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司；TRIzol購(gòu)自天根公司；引物由北京奧科公司合成。

1.2 血管平滑肌細(xì)胞原代分離與培養(yǎng)[3]

取SD大鼠，無菌操作取出主動(dòng)脈，放入DHank's液中反復(fù)沖洗，去除殘留血液，用小鑷子剝?nèi)ネ饽?，用解剖剪縱行剪開血管，在培養(yǎng)皿中用消毒的棉簽小心擦去內(nèi)膜，用解剖剪將血管剪碎，大小為1 mm見方，將組織塊放入培養(yǎng)瓶中鋪開，間距以0.5 cm為宜，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來放入培養(yǎng)箱中靜置4～5 h，取出培養(yǎng)瓶并小心加入培養(yǎng)基至剛好覆蓋組織塊，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，1周后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待長(zhǎng)至鋪滿80%時(shí)用0.25%的胰酶消化傳代，待傳入培養(yǎng)皿中靜置時(shí)吸取上清液離心重懸接種于另一培養(yǎng)皿中，如此反復(fù)多次用差速貼壁法純化細(xì)胞直至5～7代。

1.3 鈣化模型建立[2]

將原代培養(yǎng)的5～7代細(xì)胞傳代培養(yǎng)，首先用含10%血清的正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%左右時(shí)，加入含10 mmoL/L β-GP的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)鈣化，對(duì)照組則繼續(xù)用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2 d換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)10 d。

1.4 鈣化模型染色鑒定[2]

鈣化細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用1×PBS洗3次，六孔板中加入500 μL/孔4%多聚甲醛，37℃固定25 min，然后用去離子水洗3次，加入500 μL 1%茜素紅，室溫溫育25 min，吸去染液，用去離子水洗4次，在通風(fēng)櫥中干燥2～3 min，吹干去離子水，于倒置顯微鏡下觀察鑒定并拍照記錄。

1.5 RNA提取及半定量PCR

收取鈣化不同時(shí)間點(diǎn)（0、2、4、6、8、10 d）的細(xì)胞，加入1 mL TRIzol裂解，用氯仿抽提RNA，異丙醇沉淀RNA，并用75%的乙醇洗滌RNA沉淀物2次，用100 μL DEPC水溶解RNA；取2 μg RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，取2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增基因，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min、95℃變性 45 s、58℃退火 30 s、72℃延伸 1 min。Rat OPG上游引物為5'-AGTTTATTTAACAGACTGCCA CCAG-3'，下游引物為5'-GTAATAAGAGGGCGCA TAGTCAGTA-3'；Rat RANKL上游引物為5'-CGCT CTGTTCCTGTACTTTCGAGCG-3'，下游引物為5'-TCGTGCTCCCTCCTTTCATCAGGTT-3'；Rat β-actin上游引物為5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，下游引物為5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。

2 結(jié)果

2.1 caspase-1抑制劑zVAD可以下調(diào)OPG/RANKL的表達(dá)

將VSMC分為2組，一組添加zVAD，另一組不加zVAD，只加入zVAD的溶劑DMSO，2組用β-GP分別誘導(dǎo) 0、2、4、6、8、10 d，收取細(xì)胞裂解液提取總RNA，對(duì)OPG、RANKL進(jìn)行半定量PCR檢測(cè)，并通過凝膠電泳檢測(cè)OPG及RANKL的表達(dá)，結(jié)果見圖1，單加入β-GP后OPG和RANKL等基因的轉(zhuǎn)錄水平在鈣化第2 d開始上升，但加入caspase-1抑制劑zVAD后OPG、RANKL轉(zhuǎn)錄水平降低，表明抑制炎癥小體中caspase-1的活性，能夠抑制OPG和RANKL的轉(zhuǎn)錄水平。

2.2 caspase-1抑制劑zVAD抑制動(dòng)脈鈣化的程度

從圖1可以看到caspase-1抑制劑zVAD可下調(diào)OPG/RANKL的表達(dá)，接下來我們通過茜素紅鈣化染色研究caspase-1抑制劑zVAD對(duì)動(dòng)脈鈣化的影響，茜素紅鈣化染色呈紅色的細(xì)胞說明發(fā)生了鈣化。結(jié)果見圖2，細(xì)胞用zVAD處理后，鈣化程度相對(duì)于未加入zVAD組明顯改善。

3 討論

圖1 caspase-1抑制劑zVAD可以下調(diào)OPG/RANKL的表達(dá)

OPG是一種分泌糖蛋白，是腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族成員，在骨的穩(wěn)態(tài)平衡中起重要的調(diào)節(jié)作用，最近發(fā)現(xiàn)OPG與血管鈣化密切相關(guān)。OPG主要在平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮組織細(xì)胞中表達(dá)，是RANKL和TRATL的受體，OPG與RANKL和TRATL結(jié)合[4]，抑制了RANKL和TRATL與其同族受體的結(jié)合，從而抑制了特異性前炎癥和前凋亡信號(hào)通路的活性。OPG參與血管細(xì)胞因子之間的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系[5]，前炎癥細(xì)胞因子如TNF-α及血小板衍化生長(zhǎng)因子[6]在內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中能誘導(dǎo)OPG表達(dá)，從而使OPG參與各種炎癥信號(hào)通路。

圖2 caspase-1抑制劑zVAD抑制動(dòng)脈鈣化的程度

我們的研究發(fā)現(xiàn)，OPG在β-GP誘導(dǎo)的VSMC鈣化發(fā)生過程中表達(dá)上升，RANKL也有類似結(jié)果。對(duì)于OPG在鈣化發(fā)生期間持續(xù)表達(dá)，許多學(xué)者認(rèn)為是一個(gè)血管代償性的防御機(jī)制，在動(dòng)脈粥樣硬化或血管疾病高危情況下，為了使過度激活的炎癥通路和其他有害刺激降到正常水平而使OPG上調(diào)[7-8]。茜素紅染色顯示β-GP刺激VSMC后2 d開始出現(xiàn)明顯的鈣鹽沉積，而Nalp3炎癥小體在早期（加入β-GP 0.5 d，結(jié)果未示）就開始被激活；另外，在我們加入炎癥小體抑制劑zVAD后，OPG/RANKL的表達(dá)量增加過程減緩且鈣化程度減弱，這表明炎癥小體反應(yīng)是OPG/RANKL的上游事件。這個(gè)過程中是否還存在其他的調(diào)節(jié)因子并不清楚，有待進(jìn)一步研究。

[1] 程孝中,黃蓓,鐘輝.動(dòng)脈鈣化發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2010,21(1):112-115.

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