郭紫芬，軒貴平，陳方方，張式一

南華大學 藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001

定點突變是分子生物實驗常用的技術之一[1]，目前實驗室研究常規(guī)使用試劑盒進行定點突變，如Ta?KaRa公司的多點突變試劑盒[2]、Stratagene公司的定點突變試劑盒[3]。試劑盒不僅價格較昂貴，技術要求程度相對較高，且具體的突變效率也有待進一步驗證。重疊延伸PCR技術（splicing by overlap exten?sion PCR，SOE PCR）是一種特殊的PCR技術，該技術采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。因此，此技術能在體外進行有效的基因拼接、重組，在基因的定點突變方面有著廣泛而獨特的應用[4-11]。但傳統(tǒng)的重疊延伸PCR技術需要依靠瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物，此過程繁瑣、不經濟。在本實驗中，我們采用重疊延伸PCR技術結合冷凍析出目的片段的方法，減少了繁瑣的瓊脂糖凝膠回收步驟，同時設計的點突變引物使突變位點位于引物中間位置，且上下游引物完全互補，使引物設計更加方便，突變成功率也有所保證，節(jié)省了大量時間，突變效率高，能一次實現(xiàn)多位點的突變，方便廉價，目前不失為一種值得推廣的節(jié)約資源的多位點突變方法。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5ɑ為本實驗室保存；野生型質粒模板是將人線粒體基因中包含熱點突變位點的基因片段插入T載體，且經測序確證序列，用質粒提取試劑盒提取野生型質粒作為模板，在此基礎上實現(xiàn)不相鄰三位點的同時突變，為試驗前期工作結果。質粒小提試劑盒（離心柱形）Plasmid Mini KitⅠ購自Omega公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System購自Promega公司；高保真度Pfx DNA聚合酶購自Invitrogen公司；限制性內切酶HindⅢ、EcoRⅠ，10×M緩沖液、10×上樣緩沖液購自TaKaRa公司。

1.2 引物合成

利用Muta Primer 2.0設計3對定點突變引物，突變位點分別位于人線粒體基因的961、1494和1555位，且均在引物的中間位置，每對引物均為完全互補引物；同時合成pMD-19T載體的一對通用引物。引物序列見表1。

1.3 單重PCR反應

以野生型質粒為模板，引物如表2所示，進行高保真DNA聚合酶介導的雙向引物延伸反應，分別得到A、B、C、D共4段PCR產物。PCR反應體系包括模板1 μL，上、下游引物各1 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，50 mmol/L MgSO40.5 μL，Enhanced 緩沖液1.25 μL，Pfx酶0.5 μL，10×Pfx酶緩沖液2.5 μL，加水至25 μL。PCR反應條件：94℃預變性2 min；94℃變性15 s，55℃退火 30 s，68℃延伸 60 s，30個循環(huán)；4℃降溫。

用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測A、B、C、D各段，分別切下含各目的片段的膠條，于-80℃冷凍20 min后，于4℃、12 000 r/min離心5 min，取上清析出液作為模板，進行重疊PCR。

1.4 重疊PCR反應

分別取單重PCR的冷凍析出液2 μL混合，作為模板將2段融合，引物與模板的組合如表3，其他反應體系和反應條件同單重PCR，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產物，證實為兩目的片段并同單重PCR進行冷凍析出。取重疊PCR產物A+B、C+D段的冷凍析出液各2 μL混合作為模板，以RVM、M13為引物，按單重PCR體系和條件再次進行重疊PCR反應。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收重疊PCR產物，即融合片段A+B+C+D段。

1.5 突變目的片段的體外重組

將回收的突變目的片段用HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切，與經相同酶切的野生型質粒模板連接，用化學轉化法轉入大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)于含100 μg/mL氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基上，挑取單克隆陽性菌落過夜振蕩培養(yǎng)，并以RVM和M13為引物，通過菌液PCR法鑒定陽性克隆，取陽性克隆的菌液交上海生工生物工程公司測定其基因序列。

2 結果

2.1 重疊延伸PCR反應

通過單重PCR擴增得到A、B、C、D共4個PCR片段，與各段預計目的片段A（251 bp）、B（530 bp）、C（82 bp）、D（242 bp）大小一致（圖1）。通過重疊PCR得到融合A+B段、C+D段和融合全長目的片段，也與預計目的片段A+B段（781 bp)、C+D段（324 bp）和融合全長（1105 bp）大小一致（圖2）。

2.2 突變目的片段的體外重組

全長突變目的片段與野生質粒模板的HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切結果如圖3，各條帶位置正確?；厥彰盖心康钠魏唾|粒，連接后轉化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細胞，隨機挑取12個單克隆陽性菌落，振蕩培養(yǎng)，得到10管單克隆陽性菌液，分別用M13和RVM引物進行菌液PCR初步篩選，得到轉化成功的陽性菌液8管。取PCR反應陽性的菌液各1 mL，交上海生工生物工程公司進行基因測序，結果經Blast同源性分析，表明6個樣本同時包含3個定點突變位點，而其他2個樣本同時出現(xiàn)了1個非定點突變位點。突變成功的部分測序結果如圖4。

表1 重疊延伸PCR引物序列

表2 單重PCR各段引物名稱

表3 重疊PCR反應引物與模板

3 討論

圖1 單重PCR擴增各片段

圖2 重疊PCR擴增各片段

目前的多點突變試劑盒層出不窮。TaKaRa公司的Multipoints Mutagenesis Kit的原理，是設計合成同一方向的錨定引物及定點突變引物，將錨定引物及定點突變引物用T4多聚核苷酸激酶磷酸化后與模板質粒DNA進行退火，再用T4DNA聚合酶和T4DNA連接酶進行延伸和連接形成突變單鏈，然后用錨定引物“尾巴”上的特異性引物（ETail F/ETail R）和高保真DNA聚合酶PrimeSTAR對突變單鏈進行PCR擴增，再將獲得的雙鏈PCR產物克隆回原載體中，即可達到實驗目的，獲得目的突變體。本實驗室曾3次運用該試劑盒進行三位點突變，結果3次的測序結果均顯示無任何定點突變產生。其原因可能是定點突變引物同錨定引物與質粒退火過程不能保證所有引物均與模板相連，從而導致突變位點的引入困難。應用重疊延伸PCR技術，采用突變位點位于引物中間位置的完全互補引物，PCR擴增出的產物也必定包含引物上的突變位點，相比傳統(tǒng)的突變位點位于引物兩端而言，既能方便引物設計，又能保證突變位點的順利引入，提高突變效率。同時，采用冷凍析出法代替各步PCR產物回收，是考慮到PCR需要的模板量相對較少。也有用上一步PCR產物直接作為模板進行下一步PCR反應的[12]，但PCR產物中有酶、引物和質粒模板，會使非特異性擴增幾率加大，也可能會干擾重疊PCR反應條件，使產物特異性下降。對于剩余引物的干擾問題，雖然有學者提出不對稱PCR解決方法，但該方法過于繁瑣，需要反復優(yōu)化條件[13-15]。本實驗采用切膠條冷凍析出法，切下的只是包含單重PCR目的條帶的部分，經-80℃快速冷凍，離心析出，可方便快捷地得到少量目的產物，作為模板既能保證特異性和需要量，又能使PCR反應更易調控。因此，這種改進的重疊延伸PCR構建同時包含多位點突變質粒，相比本實驗室前期所應用的試劑盒，具有高效、廉價、突變特異性高的優(yōu)點，同時又簡便于傳統(tǒng)的重疊延伸PCR技術，值得在分子生物學領域發(fā)揮更高的使用價值。

圖3 質粒與融合全長片段的雙酶切

圖4 質粒載體部分測序結果比對圖A、B、C：前期構建的野生型質粒；D、E、F：本實驗構建的突變型質粒D：1555位T突變?yōu)镃；E：1494位G突變?yōu)锳；F：961位缺失A

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