王劍蓉，陳 劼，孫 怡，李 惠，賴(lài)仁勝

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科國(guó)家中管局三級(jí)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029）

·論 著·

肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體基因測(cè)序分析

王劍蓉，陳 劼，孫 怡，李 惠，賴(lài)仁勝

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科國(guó)家中管局三級(jí)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029）

目的 探討中國(guó)人肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變狀態(tài)。方法用基因測(cè)序的方法檢測(cè)了416例肺癌腫瘤細(xì)胞標(biāo)本EGFR基因第18、19、21外顯子，并檢測(cè)了其中11例EGFR第20外顯子區(qū)域。23例肺癌患者血液標(biāo)本作為對(duì)照。結(jié)果416例腫瘤標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)118例(28.37%)EGFR基因突變，其中19外顯子缺失突變占46.09%，21外顯子點(diǎn)突變占42.19%，并發(fā)現(xiàn)了4例EGFR第20外顯子區(qū)域突變(4/11)。23例肺癌患者血液標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)突變。肺腺癌的突變率為32.52%，比鱗癌(12.96%) (P=0.004)、其他類(lèi)型癌(13.89%)(P=0.021)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EGFR基因突變?cè)谂曰颊咧?36.72%)所占比例比男性患者高(22.18%)(P=0.001)。結(jié)論女性、肺腺癌患者EGFR突變率高，提示可能在表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑的治療中獲益。

EGFR基因；突變；肺癌

肺癌是當(dāng)今世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一?；熢谥型砥诜切〖?xì)胞肺癌(NSCLC)治療中占據(jù)主要地位，但療效不盡如人意。近幾年，以表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)為靶點(diǎn)的分子靶向治療在NSCLC的治療中日漸突出。根據(jù)分子標(biāo)志選擇EGFR-TKIs受益人群，是優(yōu)化治療的重要環(huán)節(jié)。因此采用EGFR基因狀態(tài)作為預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物，指導(dǎo)EGFR-TKIs的治療，是一個(gè)重要而又有實(shí)際意義的問(wèn)題。為探討中國(guó)人群EGFR基因突變狀態(tài)，2008-2012年我們對(duì)416例肺癌腫瘤標(biāo)本及23例血液標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因測(cè)序，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 分組 觀(guān)察組416例均為腫瘤標(biāo)本，其中有376例肺癌石蠟標(biāo)本、34例癌性胸水、2例新鮮組織、4例痰細(xì)胞涂片。男性239例，女性177例，年齡29～87歲，平均62.0歲；其中肺腺癌326例、鱗癌54例、其他類(lèi)型癌(包括腺鱗癌、小細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌等)共36例。所有腫瘤組織均經(jīng)病理確診。對(duì)照組23例經(jīng)病理確診的肺癌患者血液標(biāo)本，男性14例，女性9例，年齡43～82歲，平均64.5歲。每例抽取靜脈血2 ml。

1.2 引物 經(jīng)NCBI提供的EGFR全基因組序列(NM-005228)和mRNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物，見(jiàn)表1。

表1 EGFR基因外顯子18、19、20、21PCR擴(kuò)增引物序列

1.3 基因測(cè)序方法 416例腫瘤標(biāo)本用Omega公司試劑盒，23例血液標(biāo)本DNA用Promega公司試劑盒提取DNA。以凝膠電泳系統(tǒng)檢測(cè)DNA模板的質(zhì)量，用Eppendorf核酸定量?jī)x測(cè)定DNA含量大于20 ng/μl納入檢測(cè)。PCR擴(kuò)增：使用ABI-2700型測(cè)序級(jí)擴(kuò)增儀，擴(kuò)增目的基因片段。PCR產(chǎn)物利用ABI 3100I-Avant測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)有缺失或突變的病例，都用反向引物進(jìn)行反向測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用行X列表χ2檢驗(yàn)，結(jié)果均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，必要時(shí)用Fisher精確概率法。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR基因突變與肺癌組織學(xué)分型 觀(guān)察組416例腫瘤標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)118例(28.37%)EGFR基因突變，其中肺腺癌的突變率為32.52%，比鱗癌(12.96%)(χ2=8.48，P=0.004)和其他類(lèi)型癌(13.89%) (χ2=5.29，P=0.021)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但鱗癌與其他類(lèi)型癌的突變率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.04，P=0.899)，見(jiàn)表2。

表2 觀(guān)察組EGFR基因突變與肺癌組織學(xué)分型（例）

2.2 EGFR基因突變與性別 EGFR基因突變?cè)谂曰颊咚急壤?6.72%，顯著高于男性的22.18%，見(jiàn)表3。

表3 觀(guān)察組EGFR基因突變與性別的關(guān)系(例)

2.3 不同標(biāo)本類(lèi)型EGFR基因突變率 觀(guān)察組416例標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)118例(28.72%)EGFR基因突變，腫瘤石蠟組織中EGFR突變率為28.91%(109/377)，高于癌性胸水中的突變率20.59%(7/34)。對(duì)照組23例肺癌患者血液標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)突變，見(jiàn)表4。

表4 肺癌患者腫瘤標(biāo)本EGFR突變率(例)

2.4 EGFR突變位置、頻率及類(lèi)型 416例肺癌腫瘤標(biāo)本中118例EGFR基因突變，見(jiàn)表5。突變的形式有：(1)外顯子19突變：外顯子19大部分為缺失突變，占總突變的46.09%，較多為del2235-2249，其次為del2236-2250、del2240-2254、del2240-2257、del2238 -2255、del2240-2252、del2240-2253l、del2240-2248、del2239-2247、del2239-2252、del2239-2253、del2239 -2256、del2239-2258、del2235-2250、del2236-2253、del2236-2257、del2251-2262、del2250-2264、del2241 -2249；外顯子19的插入性突變：2235 CTC ins；點(diǎn)突變 ：2237A＞T、2248G＞C和 2253A＞G、2223 C＞T (P741P)、2239-2240 TT＞CC；(2)外顯子21點(diǎn)突變：占總突變的42.19%，其中最多見(jiàn)為2573 T＞G(L858R)，占總突變的37.5%、其他類(lèi)型有：2582 T＞G、2582T＞A為少見(jiàn)的突變類(lèi)型，2497 T＞G、2504A＞T、2570 G＞A、2603 A＞G、2609 A＞G(H870R)；(3)外顯子18點(diǎn)突變：2174C＞T，缺失突變：del2127-2129；(4)外顯子20點(diǎn)突變：2361G＞A、2371位C＞T；（5）內(nèi)含子突變：外顯子18前104位內(nèi)含子A＞C、21外顯子后第94位內(nèi)含子A＞G。416例肺癌腫瘤標(biāo)本，EGFR基因突變率為28.37%，突變絕大多數(shù)位于19、21號(hào)外顯子，占總突變的88.28%。其中19外顯子缺失突變占總突變的46.09%，21外顯子點(diǎn)突變占42.19%，見(jiàn)表6。

表5 118例肺癌EGFR突變情況

表6 118例肺癌EGFR基因突變位置分布

3 討 論

EGFR在多種惡性腫瘤包括NSCLC中高表達(dá)，由于EGFR酪氨酸激酶是信號(hào)傳導(dǎo)的必要條件，因而成為腫瘤治療的重要靶分子。EGFR酪氨酸激酶是包含有1 186個(gè)氨基酸鏈的跨膜蛋白，由胞外的受體和胞內(nèi)區(qū)組成，在NSCLC的表達(dá)高達(dá)40%～80%?？笶GFR的小分子酪氨酸激酶抑制劑(如吉非替尼、埃羅替尼)較早用于治療NSCLC的研究中。

EGFR基因是ErbB家族一員，位于染色體7p12-14區(qū)。EGFR基因酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18-24編碼，在肺癌中EGFR基因突變90%以上，集中在18-21外顯子，其中特征性突變主要有：(1)19外顯子缺失，主要是編碼氨基酸（KELREAT）序列缺失，這一缺失改變了EGFR受體ATP結(jié)合囊的角度，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)小分子酪氨酸激酶抑制劑的敏感性[1]。(2)21外顯子點(diǎn)突變，第858位密碼子亮氨酸置換成精氨酸（L858R），其作用使A-loop的穩(wěn)定性增強(qiáng)，提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性。(3)20外顯子的點(diǎn)突變，主要是第790位密碼子出現(xiàn)C-T轉(zhuǎn)換（T790M），突變使得腫瘤細(xì)胞對(duì)吉非替尼或埃羅替尼產(chǎn)生耐藥性[2]。(4)18外顯子點(diǎn)突變。

對(duì)EGFR基因突變的數(shù)據(jù)分析表明，盡管突變部位分散在整個(gè)酪氨酸激酶編碼區(qū)，但89%的突變集中在19外顯子的缺失和第21外顯子的L858R點(diǎn)突變[3]。我們檢測(cè)了416例肺癌腫瘤標(biāo)本，EGFR基因突變率為28.37%，EGFR的基因突變位于18～21號(hào)外顯子，主要是19外顯子的缺失和21外顯子點(diǎn)突變占總突變的88.28%。其中21外顯子點(diǎn)突變最常見(jiàn)的類(lèi)型為L(zhǎng)858R。

EGFR-TKI的高敏感性與EGFR的突變明顯相關(guān)。多項(xiàng)前瞻性隨機(jī)臨床試驗(yàn)，表明吉非替尼和埃羅替尼作為一線(xiàn)治療EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌患者與化療相比，改善預(yù)后。NEJ002研究[4]顯示，吉非替尼組患者比紫杉醇加卡鉑組有一個(gè)較長(zhǎng)的中位PFS (10.8個(gè)月vs 5.4個(gè)月；HR 0.30，95%CI 0.22～0.41；P＜0.001)和較高的反應(yīng)率(73.7%和30.7%；P＜0.001)。埃羅替尼作為一線(xiàn)治療與標(biāo)準(zhǔn)化療對(duì)比治療歐洲進(jìn)展期EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌患者的一項(xiàng)多中心、開(kāi)放性、隨機(jī)的第3期試驗(yàn)[5]顯示埃羅替尼組中位PFS為9.7個(gè)月，而標(biāo)準(zhǔn)化療組為5.2個(gè)月(HR 0.37，95% CI 0.25～0.54；P＜0.000 1)，且埃羅替尼組較標(biāo)準(zhǔn)化療組副作用小。

不同的EGFR突變類(lèi)型預(yù)示EGFR-TKIs臨床治療效果的差異。Jackman等[6]對(duì)EGFR基因突變NSCLC患者進(jìn)行的亞組分析結(jié)果表明，19外顯子缺失患者總生存期及到進(jìn)展/死亡時(shí)間都長(zhǎng)于21外顯子L858R點(diǎn)突變者，且前者在癥狀改善方面也優(yōu)于后者。應(yīng)用吉非替尼治療NSCLC患者中19外顯子的堿基缺失突變生存期明顯長(zhǎng)于21外顯子的點(diǎn)突變。突變導(dǎo)致EGFR活性增加，下游增殖通路被高度激活，因此稱(chēng)為EGFR的激活性突變。E746-A450缺失和L858R的突變與TKI的療效高度相關(guān)。Charpidou等[7]對(duì)568例非小細(xì)胞肺癌患者的分析結(jié)果：在所有NSCLC患者中大約90%的EGFR基因突變集中于19或21外顯子中，其中19外顯子的缺失及21外顯子中的點(diǎn)突變的患者服用EGFR-TKI的有效率均達(dá)到70%以上。

20外顯子的突變可能與腫瘤細(xì)胞的獲得性耐藥有關(guān)。應(yīng)用吉非替尼有效的EGFR基因突變患者最終會(huì)產(chǎn)生耐藥。約有一半獲得性耐藥的患者被證實(shí)在它們的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了EGFR的二次突變(T790M)。T790M突變大多數(shù)導(dǎo)致獲得性耐藥,但也與原發(fā)耐藥相關(guān)[8]。EGFR外顯子20的插入性突變(D770-N771)可以使受體對(duì)EGFR-TKI的敏感性降低100倍，臨床上也發(fā)現(xiàn)具有此突變的患者對(duì)EGFR-TKI治療反應(yīng)不明顯[9]。因此檢測(cè)EGFR不同的突變類(lèi)型有助于預(yù)測(cè)分析EGFR-TKIs治療NSCLC臨床療效。

EGFR-TKIs治療NSCLC的療效與EGFR酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域基因變異、種族、人群等多種因素有關(guān)。在非選擇性NSCLC標(biāo)本，EGFR突變率在北美為3%～25%，南歐為10%～24%[10]。美國(guó)NSCLC患者中只有約10%的突變，然而在亞洲人中，約30%的NSCLC患者有EGFR的基因突變[8，11]。

多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，亞裔、女性、無(wú)吸煙史、腺癌為吉非替尼和埃羅替尼藥物治療的優(yōu)勢(shì)人群，通過(guò)這種優(yōu)勢(shì)人群的選擇可使TKIs藥物的有效性升高到40%以上[12-14]。我們的研究再次證實(shí)了肺癌患者中女性、腺癌的EGFR突變率高，為EGFR-TKIs治療的優(yōu)勢(shì)人群，這與以往的文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。

我們檢測(cè)了416例肺癌患者腫瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)不同組織的EGFR突變率有所不同，腫瘤石蠟切片中EGFR突變率為28.91%(109/377)，高于癌性胸水中的突變率20.59%(7/34)。這可能與腫瘤組織數(shù)量及腫瘤細(xì)胞與非腫瘤細(xì)胞百分比有關(guān)。癌性胸水中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量以及與正常細(xì)胞百分比可能小于石蠟組織中，因此可能導(dǎo)致突變比例偏低。我們檢測(cè)了23例肺癌患者血液標(biāo)本，未能發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變，這可能與直接測(cè)序法的敏感性有關(guān)。直接測(cè)序法可以發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)，通過(guò)正反雙向測(cè)序進(jìn)行比較，是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但如果突變細(xì)胞比例小于百分之十，直接測(cè)序法不易測(cè)出。

肺癌腫瘤組織的EGFR基因檢測(cè)，為靶向藥物吉非替尼或埃羅替尼療效提供有效的分子水平的預(yù)測(cè)指標(biāo)，為NSCLC治療及耐藥評(píng)估提供依據(jù)，可以廣泛應(yīng)用于臨床。

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Epidermal growth factor receptor sequencing analysis in lung cancer.

WANG Jian-rong,CHEN Jie,SUN Yi,Li Hui,LAI Ren-sheng.Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,The Third Grade Laboratory of Molecular Biology of State Administration of TCM,Nanjing 210029,Jiangsu,CHINA

Objective To study the mutation patterns of epidermal growth factor receptor gene in Chinese lung cancers.MethodsEGFR exons 18,19,21 were performed in 416 tumor specimens of lung cancer by direct DNA sequencing,and exon 20 was detected in 11 patients among them.Blood samples of 23 patients were performed as controls.ResultsEGFR mutations were identified in 118 of the 416(28.37%)cases,including in-frame deletion in exon 19(46.09%)and point mutation in exon 21(42.19%),and 4 cases of exon 20 mutations were found in 11 patients.No mutation was found in the blood.The mutation rate of lung adenocarcinoma was 32.52%,which was higher than that in squamous cell carcinoma(12.96%)(P=0.004)and other types of lung cancers(13.89%)(P=0.021).The mutations occurred more frequently in females(36.72%)than in males(22.18%)(P=0.001).The mutation rate of EGFR in formalin-fixed,paraffin embedded tissue was 28.91%(109/377),which was higher than in malignant pleural effusion 20.59%(7/34).ConclusionOur data indicated that Chinese female lung adenocarcinoma patients could benefit from EGFR tyrosine kinase inhibitors.

Epidermal growth factor receptor gene;Mutation;Lung cancer

R734.2

A

1003—6350（2014）10—1405—04

2013-11-07)

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(編號(hào)：012062003010)

王劍蓉。E-mail：jrwang00@126.com