翟清燕 趙龍玉 趙鳳春 楊正友

ZH AI Qing－yan ZH AO Long－yu ZHAO Feng－chunYANG Zheng－you

（山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，山東 泰安 271018）

（Key Laboratory for Agriculture Microbiology，College of Life Science，Shandong Agricultural University，Taian，Shandong 271018，China）

近年來，隨著人們對于飲食的追求趨向營養(yǎng)化和多樣化，對豆類功能的研究也在不斷深入，豆類加工企業(yè)的競爭焦點漸漸由普通豆制品的生產(chǎn)向功能性豆制品的開發(fā)與研制轉(zhuǎn)移［1］。尤其是乳酸菌發(fā)酵豆制品以其特有的保健作用受到消費者的青睞，是一種既體現(xiàn)了乳酸菌益生特性又包含了大豆營養(yǎng)成分的新型營養(yǎng)健康食品［2］。

豆乳經(jīng)發(fā)酵后既能發(fā)揮大豆的營養(yǎng)及功能特性，又能利用益生菌的益生作用產(chǎn)生抗菌肽、胞外多糖等大豆中原來沒有的營養(yǎng)物質(zhì)，其含有的β－葡萄糖苷酶還可以水解大豆異黃酮的糖苷結(jié)構(gòu)向生物活性更高的游離型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，大大提高了大豆制品的營養(yǎng)價值［3］。但大豆中同時含有多種抗營養(yǎng)因子，包括大豆脂肪氧化酶、胰蛋白酶抑制劑［4］、植酸等，這些抗營養(yǎng)因子對其食用價值會產(chǎn)生不利影響，且大豆具有的豆腥味阻礙了其制品的進一步發(fā)展。

近年來，植物乳桿菌作為新型益生菌其潛在的益生作用被不斷挖掘，廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵生產(chǎn)中。已有研究［5］發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌不僅可以定植于腸道中加速腸道蠕動，促進營養(yǎng)物質(zhì)的快速吸收，其產(chǎn)生的醇、酸等揮發(fā)性風味物質(zhì)能夠改變豆乳的風味，賦予發(fā)酵豆乳特有的香味，同時，還可利用大豆中存在的棉籽糖等低聚糖進行發(fā)酵產(chǎn)酸，避免其被腸道微生物分解代謝產(chǎn)生CO2、H2等氣體，從而引發(fā)胃痛、胃脹、排氣、腹瀉等癥狀［6］，為功能性發(fā)酵豆乳的進一步研發(fā)生產(chǎn)提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)。本研究擬利用本實驗室分離篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的一株益生乳酸菌Lactobacillus plantarum 4發(fā)酵豆乳，對其在發(fā)酵和貯藏期間的發(fā)酵特性及貯藏穩(wěn)定性進行評價，同時探索不同處理方法對大豆抗營養(yǎng)因子的影響，為研制出一種風味和營養(yǎng)兼具的功能性發(fā)酵豆乳提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大豆：市售；

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum 4）：本實驗室保藏菌株；

MRS培養(yǎng)基、鄰苯二甲醛（OPA）、β－巰基乙醇：日本Sigma公司；

其他試劑：均為分析純，天津市凱通化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHP－9162型，上海一恒科技有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－2型，國華電器有限公司；

p H計：PHS－3C型，上海精科有限公司；

多功能榨汁機：SQ2119型，上海帥佳電子科技有限公司；

高速冷凍離心機：5804R型，德國Eppendorf公司；

紫外可見分光光度計：UV－2100型，美國Amersham Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵豆乳生產(chǎn)工藝流程

挑選大豆（無霉爛、變質(zhì)）→清洗浸泡→磨漿→過濾→分裝→滅菌（95℃，15 min）→冷卻備用→接種→37℃培養(yǎng)→后熟→成品［7］

1.2.2 Lactobacillus plantarum 4在豆乳中發(fā)酵特性的研究 將活化好的Lactobacillus plantarum 4菌種按約為1.8×106CFU／m L的接種量接種于已滅菌的豆乳中，置于37℃恒溫培養(yǎng)［8］，以p H 值降到4.5為發(fā)酵終點，每隔1 h取樣測定其p H值、滴定酸度、蛋白水解能力、活菌數(shù)、脫水收縮性等指標，并對發(fā)酵終產(chǎn)品進行感官品評。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)品貯藏穩(wěn)定性的研究 將制備好的發(fā)酵豆乳分別置于低溫（4℃）和室溫（25℃）下貯藏21 d，每隔3 d取1瓶發(fā)酵樣品，測定其p H值、滴定酸度、活菌數(shù)和脫水收縮性，作為評價其貯藏穩(wěn)定性的指標。

1.2.4 大豆抗營養(yǎng)因子的去除 大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑是大豆中兩種主要的抗營養(yǎng)因子，對其食用價值產(chǎn)生不利影響，分別運用了熱磨法、去皮法、Na HCO3溶液和檸檬酸鹽溶液浸泡等方法來處理大豆，測定不同處理方法對發(fā)酵豆乳樣品中大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑活性的影響。

（1）熱磨法：將大豆浸泡12 h后，用80～100℃的熱水磨漿；

（2）去皮法：將大豆浸泡12 h后，去皮，常溫磨漿；

（3）Na HCO3溶液浸泡：將大豆用0.25%Na HCO3溶液浸泡12 h，瀝干，常溫磨漿；

（4）檸檬酸鹽溶液浸泡：將大豆用0.2%檸檬酸鹽（檸檬酸∶檸檬酸鈉＝1∶1）溶液浸泡12 h，瀝干，常溫磨漿。

1.2.5 測定方法

（1）p H值的測定：采用精密p H計測定。

（2）滴定酸度（吉爾涅爾度°T）的測定：按GB 5413.34—2010中的方法進行測定［9］。

（3）活菌數(shù)測定：采用 MRS瓊脂培養(yǎng)基平板傾注法［10］，37℃培養(yǎng)48 h后計算菌落總數(shù)。

（4）蛋白水解能力的測定：采用鄰苯二甲醛（OPA）衍生比色法［11］，以未發(fā)酵處理的豆乳作為空白對照，測定在340 nm下的吸光值來表示發(fā)酵豆乳的蛋白水解程度。

（5）脫水收縮性的測定：稱取15.0 g發(fā)酵豆乳樣品進行過濾，21℃放置90 min，收集濾液并稱重。按式（1）計算脫水收縮性：

（6）感官評價：由10名學生志愿者組成感官品評小組，并接受感官分析培訓，分別從樣品的表觀、氣味、風味和質(zhì)地4個方面進行評價（見表1）［12］。

（7）大豆脂肪氧化酶活性的測定：參考文獻［13］。

（8）大豆胰蛋白酶抑制劑活性的測定：參考文獻［14］。

表1 發(fā)酵豆乳感官評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria of fermented soymilk

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 發(fā)酵豆乳各指標均平行測定3次，使用SPSS 17.0軟件進行方差分析，Origin 7.5軟件進行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lactobacillus plantarum 4在豆乳中的發(fā)酵特性研究

2.1.1 發(fā)酵豆乳樣品在發(fā)酵期間酸度的變化 由圖1可知，發(fā)酵豆乳樣品達到終點（p H 4.5）用時為8 h。發(fā)酵過程中，p H值一直呈下降趨勢，滴定酸度呈上升趨勢（P＜0.05）。發(fā)酵初期，p H變化較為緩慢，2 h后下降趨勢明顯變快，發(fā)酵結(jié)束時p H降到4.48；而滴定酸度從開始到發(fā)酵結(jié)束一直呈上升趨勢，這可能是由于發(fā)酵期間菌體生長代謝產(chǎn)生大量的乳酸，從而導致p H值的快速下降和滴定酸度的迅速上升。

圖1 L.plantarum 4發(fā)酵豆乳酸度變化Figure 1 Changes ofacidity of fermented soymilk with L.plantarum 4

2.1.2 發(fā)酵豆乳樣品在發(fā)酵期間活菌數(shù)的變化 由圖2可知，發(fā)酵過程中，發(fā)酵豆乳樣品中的活菌數(shù)持續(xù)升高（P＜0.05），在生長初期活菌數(shù)含量變化較緩慢，到了對數(shù)生長期間，活菌數(shù)迅速增加，6 h后趨于平緩。按照酸奶國家標準的要求，市售酸奶產(chǎn)品中必須有活菌且數(shù)量不能低于106CFU／m L，本研究利用L.plantarum 4發(fā)酵豆乳其活菌數(shù)可達到108CFU／m L以上，表明該菌株具有良好的增殖性與穩(wěn)定性。

圖2 L.plantarum 4發(fā)酵豆乳活菌數(shù)變化Figure 2 Changes of viable counts of fermented soymilk with L.plantarum 4

2.1.3 發(fā)酵豆乳樣品在發(fā)酵期間蛋白水解能力的變化 由圖3可知，發(fā)酵期間在340 nm處測定的吸光度值一直呈上升趨勢（P＜0.05），表明對蛋白質(zhì)的水解能力越來越大，有益于益生菌在豆乳中更好的生長。發(fā)酵初期，菌體生長代謝緩慢，對蛋白的水解能力較弱，隨著發(fā)酵時間的延長，菌體能夠充分水解利用豆乳中的蛋白，進而游離氨基酸含量迅速增加，吸光值隨之迅速升高。研究結(jié)果表明，蛋白水解能力高的益生菌能夠更好的在豆乳中生長且具有較高的存活率。

圖3 L.plantarum 4發(fā)酵豆乳游離氨基酸含量變化Figure 3 Changes offree amino acid content of fermented soymilk with L.plantarum 4

2.1.4 發(fā)酵豆乳樣品在發(fā)酵期間脫水收縮性的變化 由圖4可知，發(fā)酵期間，發(fā)酵豆乳的脫水收縮性整體呈下降趨勢（P＜0.05），0～3 h時豆乳呈液態(tài)，持水力較差，隨著發(fā)酵時間的延長，菌體進入對數(shù)生長期，益生菌產(chǎn)酸使蛋白質(zhì)變性凝集，脫水收縮性顯著降低。低的脫水收縮性有助于發(fā)酵豆乳的貯藏和保形能力，Roland J.Siezen等［15］研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌在生長過程中產(chǎn)生的胞外多糖可以提高酸奶產(chǎn)品的拉絲性和黏度，并降低其脫水收縮性，所以其產(chǎn)品中可以不用添加穩(wěn)定劑。

圖4 L.plantarum 4發(fā)酵豆乳脫水收縮性變化Figure 4 Changes ofsyneresis of fermented soymilk with L.plantarum 4

2.2 Lactobacillus plantarum 4發(fā)酵豆乳貯藏穩(wěn)定性的研究

2.2.1 貯藏期間發(fā)酵豆乳酸度的變化 由表2可知，L.plantarum 4發(fā)酵豆乳樣品隨著貯藏時間的延長，p H與滴定酸度相對應(yīng)，p H值越低，滴定酸度越高。低溫（4℃）貯藏期間p H和酸度值基本保持穩(wěn)定，變化幅度很小，表明L.plantarum4有較強的耐酸性，這也是儲藏期間發(fā)酵豆乳中能保持活菌數(shù)較高的原因之一。而在室溫（25℃）貯藏時，p H值和滴定酸度值變化幅度十分明顯，可能是由于在室溫條件下菌體仍能利用豆乳中的營養(yǎng)物質(zhì)進行繁殖產(chǎn)酸，不利于酸奶的貯藏和品質(zhì)控制。

表2 貯藏期間發(fā)酵豆乳酸度變化Table 2 Changes of acidity during storage time of fermented soymilk

2.2.2 貯藏期間發(fā)酵豆乳活菌數(shù)的變化 由圖5可知，將發(fā)酵豆乳樣品分別置于低溫（4℃）和室溫（25℃）條件下貯藏21 d，樣品中的活菌數(shù)均有不同程度的降低。在貯藏初期，兩種樣品中活菌數(shù)變化均不顯著，隨著貯藏天數(shù)的增加，菌體進入衰退期，活菌數(shù)明顯減少（P＜0.05）。而在相同貯藏時間內(nèi)，常溫貯藏條件下發(fā)酵豆乳中的活菌數(shù)明顯低于低溫貯藏，常溫貯藏21 d后樣品中的活菌數(shù)僅為3.38×105CFU／m L，說明發(fā)酵豆乳不適合在室溫下長時間存放，而在低溫條件下菌體生長代謝緩慢，具有良好的貯藏穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品的保存。

2.2.3 貯藏期間發(fā)酵豆乳脫水收縮性的變化 由圖6可知，低溫貯藏條件下，樣品的脫水收縮性上升幅度不明顯，其變化范圍為26.51%～30.58%，有少量乳清析出，說明低溫貯藏能夠更好地保持產(chǎn)品的持水性，使其品質(zhì)狀態(tài)不受破壞。V.Ferragut等［16］對高壓均質(zhì)豆奶的理化性質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)低溫貯藏28 d后豆奶的脫水收縮性變化不顯著，本試驗所得結(jié)論與此相符。而在室溫條件下貯藏21 d，產(chǎn)品的脫水收縮性大幅上升（P＜0.05），有大量乳清析出，這可能是由于菌體在豆乳中繼續(xù)繁殖產(chǎn)酸，破壞了原有的酸凝膠體系，導致組成發(fā)酵豆乳三維凝膠網(wǎng)絡(luò)的顆粒過度重排造成的［17］。

2.3 大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑活性抑制

通常抑制大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑活性的處理方法有：熱磨法、去皮法、Na HCO3溶液和檸檬酸鹽溶液浸泡法，本研究分別運用這4種方法來處理大豆，測定不同處理方法對樣品大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑活性的影響，結(jié)果見表3。

圖5 貯藏期間發(fā)酵豆乳活菌數(shù)變化Figure 5 Changes of viable counts during storage time of fermented soymilk

圖6 貯藏期間發(fā)酵豆乳脫水收縮性變化Figure 6 Changes of syneresis during storage time of fermented soymilk

由表3可知，不同處理方法對大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑的影響效果不同，熱磨法對兩種酶的抑制效果最為顯著（P＜0.05），經(jīng)過熱磨處理后測得的大豆脂肪氧化酶活性是原來的26.43%，胰蛋白酶抑制劑活性是未經(jīng)處理的52.45%。去皮處理測得的脂肪氧化酶活性與未經(jīng)處理的相比有所上升，可能是由于在去皮處理過程中增加了大豆與空氣的接觸，使其被氧化。Na HCO3溶液和檸檬酸鹽溶液浸泡后測得的脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑的活性也均有不同程度的降低。因此，得出熱磨法是抑制大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑的最佳方法，可以有效地去除大豆腥味，充分利用大豆的營養(yǎng)價值，而且該方法簡單易行，適用于工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

表3 處理方法對大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑活性的影響Table 1 Effect of different methods on the activity of soy lipoxygenase and trypsin inhibitor

表3 處理方法對大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑活性的影響Table 1 Effect of different methods on the activity of soy lipoxygenase and trypsin inhibitor

不同字母表示不同顯著水平（P＜0.05）。

處理方法 脂肪氧化酶 胰蛋白酶抑制劑空白 4 640.00±122.20ab 27.15±0.63a熱磨法 1 226.67±96.15d 14.24±0.81c去皮法 4 906.67±26.67a 26.20±0.25a Na HCO3 溶液浸泡 3 866.67±53.33b 21.80±1.15b檸檬酸鹽溶液浸泡 2 240.00±92.38c 24.86±0.33ab

2.4 發(fā)酵豆乳感官評定

以L.plantarum 4發(fā)酵豆乳，將發(fā)酵結(jié)束的樣品放入冰箱4℃冷藏24 h，從表觀、氣味、風味、質(zhì)地4個指標進行評價，L.plantarum 4發(fā)酵產(chǎn)品凝乳狀態(tài)良好，無沉淀和分層，無臭味、蒸煮味和豆腥味，有悅?cè)说亩瓜阄叮诟屑毮伷交?，酸甜可口，綜合得分為88.46分（表4）。

表4 L.plantarum 4發(fā)酵豆乳感官指標評價結(jié)果Table 4 The result about sensory evaluation of the fermented soymilk with L.plantarum 4

3 結(jié)論

本研究利用L.plantarum 4進行單菌發(fā)酵，該菌株在豆乳中生長良好，發(fā)酵結(jié)束時活菌數(shù)可達到2.33×108CFU／m L，蛋白水解能力和持水力都顯著增加，發(fā)酵產(chǎn)品口感細膩平滑，無乳清析出，酸甜可口，無臭味和其它不良風味，并且在低溫貯藏條件下能夠始終保持較佳的感官品質(zhì)，同時得出熱磨法是鈍化大豆脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑的最佳方法。本研究結(jié)果顯示L.plantarum 4發(fā)酵豆乳能夠大大提高豆乳的生物活性，具備明顯的潛力和優(yōu)勢，為發(fā)酵豆制品進一步應(yīng)用于實際生產(chǎn)提供了必要的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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