劉 穎 梁 盈 林親錄

LIU Ying 1，2 LIANG Ying 1，2 LIN Qin－lu 1，2

魯 倩1，2 田明慧1，2 朱鳳霞1，2

LU Qian 1，2 TIAN Ming－h(huán)ui 1，2 ZHU Feng－xia 1，2

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗室，湖南 長沙 410004）

（1.Center South University of Forestry ＆ Technology，Changsha，Hunan 410004，China；2.National Engineering Laboratory for Rice and By－product Deep Processing，Changsha，Hunan 410004，China）

南瓜又名麥瓜、番瓜、倭瓜、金冬瓜，為葫蘆科屬植物，含有淀粉、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、維生素VB、VC和鈣、磷等營養(yǎng)成分，不僅具有較高的食用價值，還具有良好的降血糖、降血壓、防癌保健等藥用價值［1］。其中的主要成分為南瓜多糖。南瓜多糖是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑，能提高機(jī)體免疫功能，促進(jìn)細(xì)胞因子生成，通過活化補(bǔ)體等途徑對免疫系統(tǒng)發(fā)揮多方面的調(diào)節(jié)作用［2］。南瓜多糖具有降血糖、降血脂、抗癌、抗氧化等作用［3－6］，此外，它還可以清除機(jī)體在代謝過程中產(chǎn)生的多種自由基包括超氧陰離子自由基（O）、羥自由基（·OH）及其活性衍生物H2O2等［7］。文章擬以南瓜多糖為研究對象，對近年來國內(nèi)外在南瓜多糖分離提取技術(shù)、抗氧化活性及分子修飾對其抗氧化功能帶來的影響等方面的研究進(jìn)行概括闡述，以期為尋找和開發(fā)一種新型的天然抗氧化劑提供理論參考。同時也為南瓜多糖在食品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 南瓜多糖的提取方式

1.1 熱水浸提法

熱水浸提法是一種常用提取方法，其操作簡單，但耗時長，得率低。游見明［8］對南瓜多糖的熱水浸提工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在料液比1∶12（m∶V），提取溫度65℃下提取150 min，南瓜多糖的提取率為2.1%左右。王強(qiáng)等［9］將南瓜于65℃下進(jìn)行干燥，粉碎得南瓜皮粉，再在液料比25∶1（V∶m），提取溫度95℃熱水中提取2次，每次提取2 h，并采用Sevage法脫蛋白（8次），其南瓜多糖得率為3.52%。推測前者提取率略低的原因可能是材料未經(jīng)過預(yù)處理，導(dǎo)致南瓜多糖溶出不充分；此外，原料來源不同也可能是造成提取率不同的原因之一。

1.2 超聲輔助法

超聲輔助法是在不改變提取物生物活性的前提下，先利用超聲波破壞植物細(xì)胞壁，來縮短提取時間，但因設(shè)備限制難以規(guī)?；a(chǎn)。向燦輝［10］以80℃下干燥、粉碎制備的南瓜粉為原料，對其多糖的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在低功率，提取溫度80℃，提取時間6 h的條件下，南瓜多糖的提取率為5.32%。王強(qiáng)等［9］以于65℃下干燥、粉碎制備的南瓜皮粉為原料，對其多糖的超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在功率600 W，提取溫度65℃，提取次數(shù)2次，每次提取時間1 h的條件下，南瓜多糖的提取率約為4.43%。二者存在差異的原因可能是在高功率的超聲處理下，南瓜中的糖類成分有所流失（如單糖、低聚糖等小分子物質(zhì)），造成得率減少。當(dāng)然原料來源不同也可能是造成提取率不同的原因之一。

1.3 微波輔助法

微波輔助法同樣可以縮短提取時間，但也因設(shè)備原因，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。趙二勞等［11］對南瓜多糖的微波輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳的提取工藝為料液比1∶110（m∶V），微波功率360 W，提取時間3 min。該條件下南瓜多糖的提取率可達(dá)3.54%。王強(qiáng)等［9］以于65℃下干燥、粉碎制備的南瓜皮粉為原料，在功率600 W條件下微波處理6 min，并進(jìn)行Sevage法脫蛋白（8次），其南瓜多糖的得率為4.52%。上述試驗說明，原料來源、微波功率、微波作用時間均可能會對南瓜多糖的提取率造成影響。

1.4 酶法

酶提取法是一種較為有效的提取方法，它可分解細(xì)胞壁使多糖更易析出，且可以降解蛋白質(zhì)，具有條件溫和、雜質(zhì)易除和得率高等優(yōu)點(diǎn)。常用的酶有纖維素酶、木瓜蛋白酶、果膠酶等。于翠芳等［12］采用纖維素酶對南瓜多糖的酶法提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在料液比1∶30（m∶V），纖維素酶濃度0.7%，提取溫度50℃，冷凍時間30 h的條件下，南瓜多糖的提取率為12.15%。孫婕等［13］對南瓜多糖的復(fù)合酶法提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：采用纖維素酶1.0%，果膠酶1.5%，木瓜蛋白酶1.0%的復(fù)合酶，在溫度40℃，p H 4.6，料液比1∶30（m∶V），時間30 min條件下南瓜多糖的提取率可達(dá)到20.13%。前者僅采用纖維素酶，而后者采用纖維素酶、果膠酶及木瓜蛋白酶，其提取率約是前者的1.65倍，且操作更簡便。說明多種酶協(xié)同提取效果優(yōu)于單一酶。

1.5 其他方法

緩凍可以使植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，使細(xì)胞組織易受損破碎，能強(qiáng)化多糖的提取，且不會破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。于斐等［14］研究表明緩凍處理可以有效提高南瓜多糖得率。向燦輝等［10］將于80℃下干燥制備的南瓜粉凍結(jié)處理24 h后，取出迅速融化，并于80℃下提取6 h，經(jīng)脫色和脫蛋白處理后，南瓜多糖得率為5.74%；而在凍融提取法的基礎(chǔ)上輔以超聲處理南瓜多糖提取率為6.05%。丁宏偉等［15］對微波輔助超聲提取南瓜多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在料液比1∶4（m∶V），微波處理3 min，超聲處理30 min，溫度70℃的條件下，南瓜多糖的提取率為3.65%。刁文超等［16］對超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取南瓜多糖的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，其最佳的工藝條件為功率440 W、提取溫度51.5℃、液料比7∶1（V∶m）、p H 4.4，此條件下，南瓜多糖的得率為4.39%。上述研究表明，微波、超聲、酶法協(xié)同提取時，可能對南瓜多糖結(jié)構(gòu)和性質(zhì)產(chǎn)生了破壞，導(dǎo)致其得率下降。

綜上所述，原料不同導(dǎo)致的提取率差異不大，但不同方法所帶來的提取率差異較為明顯。如表1所示，酶法提取南瓜多糖的得率最高，其次是超聲波輔助法，提取率最低的是傳統(tǒng)水浴法。這是因為在水浴條件下，無法破壞細(xì)胞壁，導(dǎo)致南瓜多糖不能完全釋放出來。與單一提取方法相比，超聲協(xié)同復(fù)合酶法卻沒有復(fù)合酶法提取率高，這可能是由于超聲對酶造成結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致酶活性部分喪失，故提取率下降。微波與超聲波協(xié)同使用沒有單獨(dú)提取得率高，這是因為微波處理后破壞了植物的細(xì)胞壁，使大量的多糖流出，再用超聲處理就會導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的破壞，而無法被收集。相比較幾種提取方法，凍融輔助法相較其他協(xié)同方法是最為理想的方式，該方式提取率高，不破壞多糖結(jié)構(gòu)，且提取率成本低。

表1 不同方法提取南瓜多糖的比較Table 1 Comparison of different methods to extract Pumpkin Polysaccharide

2 南瓜多糖體外抗氧化活性

2.1 消除自由基的能力

自由基的清除是利用氧自由基的氧化或還原性質(zhì)，使反應(yīng)體系中的某種反應(yīng)物發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，生成物在紫外或（和）可見光范圍內(nèi)某一特定波長下具有最大吸收峰，通過測定反應(yīng)體系在這一波長下的吸光度的變化，間接測定氧自由基的含量。其常用方法有DPPH（1，1－二苯基－2－三硝基苯肼）法、水楊酸法、超氧陰離子法等。孫婕等［6］在用不同方法提取的南瓜多糖進(jìn)行清除羥自由基試驗時得出：相同質(zhì)量濃度下，復(fù)合酶法提取所得的南瓜多糖清除羥基自由基（OH·）的能力最強(qiáng)，在南瓜多糖濃度0.3 mg／m L時清除率為40%左右，在1.8 mg／m L時可達(dá)83.2%。在清除超氧陰離子試驗中，濃度為20 mg／m L時，酶法提取的多糖清除率可達(dá)62.3%。丁宏偉等［15］采用微波輔助超聲技術(shù)提取南瓜多糖，并測定南瓜多糖對·OH、O及DPPH自由基的清除效果。結(jié)果顯示，不同濃度南瓜多糖對自由基均有較好的清除效果，特別是4 mg／m L以上時，清除效果顯著，清除超氧陰離子的效果最為顯著。綜上所述，不同提取方法對南瓜多糖清除自由基能力的效果不同，酶法提取的能力最強(qiáng)，而采用微波輔助超聲提取清除超氧陰離子的效果最好。

2.2 還原能力

測定物質(zhì)還原能力一般采用FRAP法，其中Fe3＋吡啶三吖嗪可被樣品中還原物質(zhì)還原為二價鐵形式，呈現(xiàn)出藍(lán)色，并于593 nm處具有最大吸收，根據(jù)吸光度大小計算樣品的抗氧化活性的強(qiáng)弱。李筱泉等［17］通過FRAP法測定了南瓜多糖的總還原能力。發(fā)現(xiàn)隨著多糖濃度的增加，總還原能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)南瓜多糖濃度為8 mg／m L時，其總還原能力相當(dāng)于0.66 mmo L／L Fe2＋。刁文超等［18］用 FRAP法測定南瓜多糖的總還原能力，得出南瓜粗多糖的總還原能力為0.182 mmo L／g，說明南瓜多糖具有一定的還原能力。

2.3 離體抗氧化活性能力

目前篩選及評價抗氧化活性成分的體外試驗方法主要包括化學(xué)測定法和細(xì)胞模型法［19］。化學(xué)測定法主要通過化學(xué)方法測定樣品對脂類物質(zhì)氧化的抑制能力，或?qū)θ斯ど勺杂苫那宄芰?，繼而進(jìn)行活性評價。而以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的活性篩選模型是用來研究藥物分配進(jìn)入細(xì)胞膜、藥物吸收、與載體或酶等生物大分子相互作用以及清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基的有效方法，能更準(zhǔn)確地闡述在生物體內(nèi)的抗氧化反應(yīng)機(jī)理［20］。李俊麗［21］研究了南瓜多糖體外抗氧化活性能力，發(fā)現(xiàn)南瓜多糖可抑制紅細(xì)胞的氧化損傷，保護(hù)紅細(xì)胞膜；當(dāng)南瓜多糖濃度為625～2 500μg／m L在415 nm下紅細(xì)胞溶血率為68.08%～34.99%，溶血率隨多糖濃度的增加而降低。同時，不同劑量的南瓜多糖可以抑制小鼠肝中的丙二醛（MAD）含量，在濃度為2 500μg／m L其 MDA抑制率可達(dá)64.09%，抑制率與多糖濃度呈正相關(guān)。研究南瓜多糖對Vc＋Fe2＋誘導(dǎo)小鼠肝線粒體腫脹抑制作用過程中，當(dāng)南瓜多糖濃度達(dá)3.75 mg／m L時，幾乎可以完全抑制Vc＋Fe2＋誘導(dǎo)作用，其變化與正常組一致。王運(yùn)強(qiáng)［22］在溫度為80，60，40，20℃水浴條件下提取南瓜中的多糖（pumpkin polysaccharide，PP），得到4種水溶性南瓜多糖 PP4、PP3、PP2和PP1，經(jīng)小鼠體外抗氧化試驗，發(fā)現(xiàn)南瓜多糖濃度的逐漸增大，對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化抑制能力逐漸加強(qiáng)。其中抑制能力最強(qiáng)的是PP1。當(dāng)4種水溶性南瓜多糖濃度均為2 mg／m L時，對小鼠肝線粒體腫脹有抑制作用。效果最顯著的也是PPl。推測是由于溫度過高對南瓜多糖提取造成負(fù)影響，造成其活性物質(zhì)的部分損失，導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)清除自由基的能力降低，因此低溫提取條件得到的南瓜多糖脂質(zhì)過氧化抑制能力最強(qiáng)。

3 南瓜多糖的體內(nèi)抗氧化活性研究

3.1 南瓜多糖的消化率

南瓜中所含果膠為天然的低甲氧果膠，在沒有糖存在的情況下可以形成穩(wěn)定的凝膠，保護(hù)胃粘膜，加快潰瘍面愈合，對消化道潰瘍具有一定療效。另一方面南瓜所含成分（如多糖、膳食纖維等）能促進(jìn)膽汁分泌，加強(qiáng)胃腸蠕動，幫助食物消化［23］。金暉等［24］探討了南瓜多糖在體外模擬人工胃液中的動態(tài)變化過程，發(fā)現(xiàn)隨胃酸與胃酶作用時間的延長，還原糖的量緩慢增加，高效凝膠滲透色譜結(jié)果顯示作用30 min時出現(xiàn)小分子糖，其還原糖量為0.259 8μg／μL，作用90 min時大分子量多糖出現(xiàn)明顯變化，得出南瓜多糖在攝入人體30 min內(nèi)就被人體所消化吸收，而同樣條件下紅薯淀粉在人工胃液中的還原糖量為0.087 55μg／μL，可以推測出南瓜多糖是較易被人體消化吸收的［25］。

3.2 動物試驗

眾所周知，隨著年齡的增長，體內(nèi)自由基含量增多，T細(xì)胞受損，免疫功能下降，導(dǎo)致衰老，同時帶來心腦血管疾病的隱患。研究發(fā)現(xiàn)某些多糖既可以從整體上提高機(jī)體的免疫功能［26］；又可以抑制脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)機(jī)體對自由基的清除能力［27］，延緩衰老［28］，抑制心腦血 管疾病的發(fā)生［29］。朱 紅艷等［30］建立了用胰島素和高糖來誘導(dǎo)的胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型，并驗證南瓜多糖對胰島素抵抗脂肪細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。結(jié)果表明，南瓜多糖可以增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞對葡萄糖的消耗，而胰島素抵抗脂肪細(xì)胞中PPARγ表達(dá)明顯低于正常對照組。說明南瓜多糖可能通過提高PPARγ的表達(dá)來改善胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型的胰島素抵抗性。潘洪志等［31］采用灌胃的方式來觀察染鉛小鼠抗氧化系統(tǒng)的改變及南瓜提取物對抗氧化酶系統(tǒng)的影響。結(jié)果得出鉛中毒可以引起小鼠過氧化損傷，南瓜多糖可以減輕鉛中毒引起的脂質(zhì)過氧化，提高小鼠機(jī)體的抗氧化能力。劉穎等［32］將糖尿病大鼠根據(jù)血糖和體重隨機(jī)分為糖尿病組和南瓜多糖組，同時與正常組進(jìn)行對照，并分別給予蒸餾水和南瓜多糖灌胃，每周測量體重1次，4周后測定大鼠的血清總膽固醇、空腹血糖、高密度脂蛋白、甘油三酯、游離脂肪酸和低密度脂蛋白的含量。結(jié)果表明，糖尿病組大鼠的高密度脂蛋白、甘油三酯、游離脂肪酸和低密度脂蛋白含量顯著增加，血液中高密度脂蛋白含量明顯降低，補(bǔ)充南瓜多糖后，甘油三酯、總膽固醇、游離脂肪酸和低密度脂蛋白含量明顯降低，而高密度脂蛋白含量升高，南瓜多糖的降脂效果明顯。證明南瓜多糖能夠有效預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生。

4 通過分子修飾提高南瓜多糖的抗氧化活性

南瓜多糖除本身具有抗氧化功效外，將其分子進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后得到的多糖較修飾前具有更高的活性或者產(chǎn)生新的活性。

4.1 羧甲基化

甲基化方法是分析多糖及其綴合物中糖結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的重要方法，可將多糖中各種單糖結(jié)構(gòu)中的游離羥基全部甲基化，并將甲基化多糖進(jìn)行水解得到部分甲基化的單糖，通過分析水解后的單糖，來推測多糖分子中各單糖間連接位置［33］。多糖甲基化方法很多，如Purdie法、Cicanu法、Menzies法、Haworth法、Hakomori法及液氨甲基化等。柳紅等［34］采用超聲輔助法提取南瓜多糖并對其進(jìn)行分離和羧甲基化；鄰苯三酚自氧化法測定羧甲基南瓜多糖對超氧陰離子自由基的清除作用，結(jié)果證明羧甲基化后的南瓜多糖具有更好的抗氧化活性。

4.2 硫酸化

在結(jié)構(gòu)修飾中，硫酸酯化是一個頗為有效的修飾手段，多糖大分子中單糖的某些羥基用硫酸根取代，進(jìn)而加強(qiáng)了多糖分子的固有生物活性。但其穩(wěn)定性還需進(jìn)一步研究。謝佳等［35］采用氯磺酸—吡啶法，對南瓜粗多糖和分離得到的南瓜PP1多糖進(jìn)行硫酸酯化，結(jié)果表明水提南瓜多糖、水提南瓜AP1多糖（采用十六烷基三甲基溴化銨沉淀法，即CTAB法沉淀得到南瓜多糖為南瓜AP1多糖）、硫酸酯化水提南瓜多糖、硫酸酯化水提南瓜AP1多糖南瓜多糖均能有效清除·OH，隨著濃度的上升，清除效果愈明顯，且采用水法提取的南瓜粗多糖對·OH清除作用明顯優(yōu)于另外3種多糖。而南瓜AP1多糖和南瓜粗多糖對O的清除作用不顯著，但經(jīng)硫酸酯化的多糖可以有效清除O，且呈量效關(guān)系?？踪坏龋?6］采用三氧化硫—吡啶法對南瓜多糖PL2－1進(jìn)行硫酸酯化修飾，但硫酸酯化修飾取代度不高。其原因可能是南瓜多糖的游離羥基不多，供硫酸酯化的機(jī)會較低。

4.3 磷酸化

多糖不僅本身具有多種生物活性，它們的衍生物也具有獨(dú)特的作用。磷酸酯是多糖衍生物中重要的一類，也是研究多糖構(gòu)效關(guān)系的重要組成部分，對開發(fā)多糖藥物具有深遠(yuǎn)意義。常用于多糖磷酸化的試劑有：三氯氧磷、磷酸及其酸酐、磷酸鹽等。吳瓊等［37］用三氯氧磷（POCl3）對銀耳多糖進(jìn)行處理，并在60℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)40 min，分離得到了4種磷酸化銀耳多糖。銀耳多糖中羥基的取代度越大，溶解性越好，并進(jìn)行體外清除自由基試驗，結(jié)果表明，修飾后的銀耳多糖與修飾前的相比清除DPPH自由基能力明顯增強(qiáng)。由此推測南瓜多糖也可做類似修飾來改變其分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高或改變其化學(xué)性質(zhì)和生理活性，為今后的應(yīng)用提供了方向。

從上述結(jié)果可以看出無論是經(jīng)過羧甲基化、硫酸酯化還是磷酸化都提高了南瓜多糖體外清除自由基的作用。硫酸酯化與多糖中游離羥基含量有關(guān)，而磷酸化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)可控性較差，增加了難度。多糖的硫酸酯化和磷酸化同為聚陰離子修飾，卻因其合成方面的瓶頸而沒有得到廣泛而系統(tǒng)的研究。而羧甲基化制備過程簡單，試劑成本低，產(chǎn)物無毒性等特點(diǎn)，是一種比較理想的衍生方法。

5 展望

多糖為非細(xì)胞毒性物質(zhì)，藥物質(zhì)量可通過化學(xué)手段進(jìn)行控制，并且毒副作用小，在醫(yī)藥學(xué)研究領(lǐng)域有著相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景。由于南瓜多糖成本低廉，操作簡單深受企業(yè)的青睞，為其開發(fā)利用提供了廣闊的市場。目前對其研究報道主要集中在降血糖、降血脂方面，而對南瓜多糖抗氧化活性及其作用機(jī)制的研究還未見詳細(xì)報道，其體內(nèi)水平、動物水平、細(xì)胞水平及分子水平的抗氧化活性機(jī)理的研究均不透徹，還有待進(jìn)一步深入探討。此外，關(guān)于南瓜多糖結(jié)構(gòu)修飾及其帶來的影響還不夠清晰，對南瓜多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而改變其抗氧化性、溶解性等其他功能性質(zhì)，也是后續(xù)的研究方向之一。

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