梁曉陽，劉洛同，明揚(yáng)，陳禮剛

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 瀘州 646000）

·論著·

人腦膠質(zhì)瘤中Fas、Caspase-8的表達(dá)

梁曉陽，劉洛同，明揚(yáng)，陳禮剛

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 瀘州 646000）

目的探討不同級別膠質(zhì)瘤中Fas、Caspase-8的表達(dá)情況。方法針對68例經(jīng)病理證實(shí)的人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本和15例正常對照標(biāo)本，采用免疫組化SP法檢測Fas、Caspase-8的表達(dá)。結(jié)果在低級別膠質(zhì)瘤(LGG，Ⅰ～Ⅱ級)和高級別膠質(zhì)瘤(HGG，Ⅲ～Ⅳ級)中，F(xiàn)as陽性率分別為60.6%(20/33)和91.4%(32/35)，Caspase-8的陽性率分別為81.8%(27/33)和48.6%(17/35)。膠質(zhì)瘤病理分級越高，F(xiàn)as的陽性率越高(χ2=8.968，P=0.003<0.05)，Caspase-8的陽性率越低(χ2=8.221，P=0.004<0.05)。膠質(zhì)瘤的惡性程度與Fas的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.536，P<0.001)，與Caspase-8的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.348，P<0.01)。結(jié)論膠質(zhì)瘤細(xì)胞可對Fas系統(tǒng)誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生耐受，Caspase-8功能的下降與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

膠質(zhì)瘤；Fas；Caspase-8；免疫組化

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)腫瘤，呈浸潤性生長，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。目前膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，有證據(jù)顯示膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[1-3]。Fas是一種死亡受體，凋亡蛋白酶-8(Caspase-8)是細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用的凋亡蛋白酶，它們介導(dǎo)了多種細(xì)胞的凋亡。研究表明，F(xiàn)as和Caspase-8與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]，但目前同時檢測二者在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)并探討其相互作用的研究相對較少。本研究對68例膠質(zhì)瘤組織及15例正常腦組織中Fas和Caspase-8的表達(dá)進(jìn)行了檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2010年6月至2013年5月經(jīng)手術(shù)證實(shí)的膠質(zhì)瘤病例68例(均為初發(fā)病例，首次手術(shù)，術(shù)前均未接受放療和化療)，其中男性32例，女性36例，年齡4～79歲，平均49.8歲。年齡<20歲6例，20～50歲26例，>50歲36例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診，參照2000年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類和分級標(biāo)準(zhǔn)：低級別(LGG，Ⅰ～Ⅱ級)33例(其中彌漫性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤16例，纖維性星形細(xì)胞瘤10例，毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤2例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤5例)，高級別(HGG，Ⅲ～Ⅳ級)35例(其中間變性星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤16例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤19例)。另取15例因重型顱腦外傷行內(nèi)減壓術(shù)切除的創(chuàng)傷周邊相對正常的腦組織作為對照組。

1.2 主要試劑和儀器鼠抗人CD95單克隆抗體(Bioworld公司)；兔抗人Caspase-8單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；組織切片機(jī)(美國Thermo公司)；普通光學(xué)顯微鏡(Motic BA200型)；Image-Pro Plus軟件系統(tǒng)(美國MEDIA CYBERNETICS公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(WK891型)。

1.3 Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)水平采用免疫組化SP法檢測Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)水平。所有標(biāo)本取材后制成連續(xù)石蠟切片。膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行HE染色，確定病理分級。用二甲苯及酒精脫蠟脫苯，EDTA溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，一抗孵育30 min，水洗2～3 min，加入TBS緩沖液，二抗孵育30 min，水洗2～3 min，再加入TBS緩沖液，DAB顯色劑顯色，蘇木素復(fù)染。以TBS代替一抗作陰性對照。在切片染色均勻的腫瘤區(qū)域隨機(jī)取5個高倍視野(400×)，共計500個細(xì)胞，按染色強(qiáng)度(Staining intensity，SI)和陽性細(xì)胞百分率(Percentage of positive cells，PP)的乘積計算免疫反應(yīng)評分(Immunoreactive score，IRS)，IRS=SI×PP。SI計分：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。PP計分：無陽性細(xì)胞0分，陽性細(xì)胞率≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。IRS表達(dá)強(qiáng)度判斷：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計軟件為SPSS11.5軟件包，其中定性資料采用卡方檢驗(yàn)，組間比較采用等級資料秩和檢驗(yàn)，樣本表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級之間的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Fas在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)免疫組化染色顯微鏡下觀察可見，F(xiàn)as主要表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，陽性表達(dá)為胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色或黃色(圖1)。Fas在膠質(zhì)瘤組織中的陽性率為76.5%(52/68)，其中在低級別膠質(zhì)瘤和高級別膠質(zhì)瘤中的陽性率分別為60.6%(20/33)和91.4%(32/35)，而在正常腦組織中的陽性率為20.0%(3/15)。Fas表達(dá)陽性率隨膠質(zhì)瘤惡性程度的增強(qiáng)而增高(χ2=8.968，P<0.01)，低級別膠質(zhì)瘤組織Fas陽性率顯著高于正常腦組織(P< 0.01)，高級別膠質(zhì)瘤組織中Fas陽性率也顯著高于低級別膠質(zhì)瘤組織(P<0.01)和正常腦組織(P<0.001)，F(xiàn)as的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)(rs=0.536，P<0.001，表1)。

圖1 Fas在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（免疫組化×400）

表1 Fas在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(例)

2.2 Caspase-8在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)免疫組化染色顯微鏡下觀察可見，Caspase-8主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，陽性表達(dá)為胞質(zhì)呈淡黃色或黃色(圖2)。Caspase-8在膠質(zhì)瘤組織中的陽性率為64.7%(44/ 68)，其中在低級別膠質(zhì)瘤和高級別膠質(zhì)瘤中的陽性率分別為81.8%(27/33)和48.6%(17/35)，而在正常腦組織中的表達(dá)為20.0%(3/15)。Caspase-8表達(dá)陽性率隨膠質(zhì)瘤病理分級的增強(qiáng)而降低(χ2=8.221，P< 0.01)，低級別膠質(zhì)瘤組織Caspase-8陽性率顯著高于高級別膠質(zhì)瘤組織(P<0.01)和正常腦組織(P<0.001)，高級別膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.059)，Caspase-8的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.348，P<0.01，表2)。

圖2 Caspase-8在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（免疫組化×400）

表2 Caspase-8在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(例)

3 討論

近年來膠質(zhì)瘤的發(fā)病率逐步增高，在成年人中的發(fā)病率約為6/10萬，5年存活率為20%～30%[5-6]。目前雖然在膠質(zhì)瘤的手術(shù)治療、化學(xué)治療、放療等方面取得了一定的進(jìn)展，基因治療也在積極的研發(fā)中，但總的療效仍不能令人滿意，高級別膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中位生存期仍然徘徊在12～14個月[7]。因此，有關(guān)膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的研究始終都占有重要的地位，細(xì)胞凋亡是其中的一個研究熱點(diǎn)問題。Fas是一種死亡受體，屬于腫瘤壞死因子受體家族和神經(jīng)生長因子受體家族，與其配體FasL結(jié)合后，配體化的Fas通過其死亡結(jié)構(gòu)域與適配體(Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD)肽鏈C端的死亡結(jié)構(gòu)域交連，從而使FADD募集在Fas上，F(xiàn)ADD的N端含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，可以集聚細(xì)胞凋亡蛋白酶-8酶原，繼而共同形成凋亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(Death inducing signaling complex，DISC)使Caspase-8活化，導(dǎo)致一系列凋亡蛋白酶活化，最終引起細(xì)胞凋亡。

既往有關(guān)膠質(zhì)瘤與Fas系統(tǒng)的研究多局限于Fas及其配體FasL的表達(dá)以及二者之間的相互作用，對激動Fas后的下游通路研究較少。本研究著重探討Fas的表達(dá)與其下游通路上的Caspase-8的表達(dá)之間的關(guān)系，進(jìn)而研究Fas激活與細(xì)胞凋亡之間是否存在必然聯(lián)系。林寧等[8]報道，F(xiàn)as的表達(dá)隨著腫瘤級別的增高而逐步增多，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，提示腫瘤細(xì)胞對Fas系統(tǒng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可產(chǎn)生耐受或Fas系統(tǒng)的下游可能有導(dǎo)致細(xì)胞增殖的信號通路。國外有學(xué)者[9]報道Fas基因突變導(dǎo)致Fas表達(dá)產(chǎn)生多種變化，例如Fas在細(xì)胞表面表達(dá)的下調(diào)[10]、高水平的抗凋亡蛋白等。Chen等[11]研究顯示在小鼠卵巢癌和肝癌模型中Fas通過下游通路JNK和c-Jun誘導(dǎo)腫瘤生成，提示Fas通路可能有致瘤活性，抑制Fas通路的活性而不是促進(jìn)其活性可作為腫瘤治療的研究方向。Caspase-8基因也可發(fā)生多種遺傳學(xué)改變，如基因缺失、點(diǎn)突變、甲基化，從而阻斷了凋亡蛋白酶系的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡受阻。Liu等[12]在A431人類腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)Caspase-8第二個死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域區(qū)leu62缺失，導(dǎo)致突變的Caspase-8不能形成寡聚體與FADD相互作用，使凋亡信號通路受阻。有報道顯示在人類視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，Caspase-8基因因甲基化而導(dǎo)致基因沉默，從而使Caspase-8表達(dá)下降，進(jìn)而引起凋亡受阻[13]。在轉(zhuǎn)移性神經(jīng)母細(xì)胞瘤中Caspase-8的表達(dá)被抑制，而重建Caspase-8的表達(dá)可以抑制腫瘤的生長[14]。Yamaguchi等[15]利用腺病毒載體在肝癌HCC細(xì)胞系中提高Caspase-8的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)提高Caspase-8的表達(dá)可以下調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-xL的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這些研究結(jié)果都表明Caspase-8功能的下降與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，腫瘤細(xì)胞可對Fas/FasL系統(tǒng)誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生耐受，Caspase-8基因的突變可導(dǎo)致其功能的下降或缺失，研究調(diào)控Caspase-8的相關(guān)機(jī)制，探討選擇性調(diào)節(jié)Fas/Fas L系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或增殖的機(jī)制以及與其他信號通路之間的關(guān)系將是未來研究的熱點(diǎn)問題。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，必將為膠質(zhì)瘤的治療提供特異性的靶點(diǎn)，大幅提高膠質(zhì)瘤的治療效果。

[1]Sancho-Martinez I,Martin-Villalba A.Tyrosine phosphorylation and CD95:a FAScinating switch[J].Cell Cycle,2009,8(6): 838-842.

[2]Eisele G,Roth P,Hasenbach K,et al.APO010,a synthetic hexameric CD95ligand,induces human glioma cell death in vitro and in vivo [J].Neuro Oncol,2011,13(2):155-164.

[3]Konkankit VV,Kim W,Koya RC,et al.Decitabine immunosensitizes human gliomas to NY-ESO-1 specific T lymphocyte targeting through the Fas/Fas ligand pathway[J].J Transl Med,2011,9:192.

[4]Leon-Bollotte L,Subramaniam S,Cauvard O,et al.S-nitrosylation of the death receptor fas promotes fas ligand-mediated apoptosis in cancer cells[J].Gastroenterology,2011,140(7):2011-2018.

[5]Okamoto Y,Di Patre PL,Burkhard C,et al.Population-based study on incidence,survival rates,and genetic alterations of low-grade diffuse astrocytomas and oligodendrogliomas[J].Acta Neuropathol, 2004,108(1):49-56.

[6]Goodenberger ML,Jenkins RB.Genetics of adult glioma[J].Cancer Genet,2012,205(12):613-621.

[7]Wick W,Weller M,Weiler M,et al.Pathway inhibition:emerging molecular targets for treating glioblastoma[J].Neuro Oncol,2011, 13(6):566-579.

[8]林寧,鄧家駿,付朋,等.人腦膠質(zhì)瘤中Fas系統(tǒng)與其患者外周血中MDSC表達(dá)的相關(guān)性[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志,2011,16 (2):91-93,96.

[9]Maeda T,Yamada Y,Moriuchi R,et al.Fas gene mutation in the progression of adult T cell leukemia[J].J Exp Med,1999,189(7): 1063-1071.

[10]Bullani RR,Wehrli P,Viard-Leveugle I,et al.Frequent downregulation of Fas(CD95)expression and function in melanoma[J].Melanoma Res,2002,12(3):263-270.

[11]Chen L,Park SM,Tumanov AV,et al.CD95promotes tumour growth [J].Nature,2010,465(7297):492-496.

[12]Liu B,Peng D,Lu Y,et al.A novel single amino acid deletion caspase-8 mutant in cancer cells that lost proapoptotic activity[J].J Biol Chem,2002,277(33):30159-30164.

[13]Poulaki V,Mitsiades CS,Mcmullan C,et al.Human retinoblastoma cells are resistant to apoptosis induced by death receptors:role of caspase-8 gene silencing[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2005,46 (1):358-366.

[14]Mckee AE,Thiele CJ.Targeting caspase 8 to reduce the formation of metastases in neuroblastoma[J].Expert Opin Ther Targets, 2006,10(5):703-708.

[15]Yamaguchi Y,Shiraki K,Fuke H,et al.Adenovirus-mediated transfectionofcaspase-8sensitizeshepatocellularcarcinomato TRAIL-and chemotherapeutic agent-induced cell death[J].Biochim Biophys Acta,2006,1763(8):844-853.

Expression of Fas and Caspase-8 in human glioma.

LIANG Xiao-yang,LIU Luo-tong,MING Yang,CHEN Li-gang. Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital to Luzhou Medical College,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo explore the expression and significance of Fas and Caspase-8 in human gliomas.MethodsThe expressions of Fas and Caspase-8 were detected by SP immunohistochemistry in 68 human gliomas specimens and 15 normal brain tissues,respectively.ResultsThe positive rates of Fas in low grade gliomas(LGG,ⅠandⅡ)and high grade gliomas(HGG,ⅢandⅣ)were 60.6%(20/33)and 91.4%(32/35),respectively.The positive rates of Caspase-8 were 81.8%(27/33)and 48.6%(17/35)in the LGG and HGG groups,respectively.The expression of Fas was associated with the clinical stage(P<0.05).The expression of Fas was positively correlated with the glioma grade(P<0.001).However,the expression of Caspase-8 was negatively correlated with the glioma grade P< 0.01).ConclusionGliomas cells may have the tolerance to the apoptosis induced by Fas,the decrease in the function of Caspase-8 was closely related to the occurrence and development of glioma.

Glioma;Fas;Caspase-8;Immunohistochemistry

R730.264

A

1003—6350(2014)07—0947—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.07.0368

2013-10-29)

陳禮剛。E-mail：chengligang.cool@163.com